mTOR通路調控早產鼠肺成纖維細胞在氧化細胞損傷和修復中的作用及機制.pdf

1、目的：研究不同濃度及時間氧暴露后早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況；進一步探究雷帕霉素干預后不同濃度及時間氧暴露后早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況；研究小RNA干擾后早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況，同時分析其對mTOR通路上下游主要分子的基因和蛋白表達情況；進一步探究高體積分數氧、雷帕霉素及小RNA干擾對細胞外基質各膠原、凋亡相關基因和促纖維化因子的蛋白表達影響。
　　方法：實驗對象為早產小鼠肺成纖維細胞即L929細胞。將新鮮完全

2、培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞于21％，40%，60%，90%的氧濃度暴露3、7、14天后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數目變化，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡，MTT法評估細胞增殖；將含有10nM雷帕霉素的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞于21%，40%，60%，90%的氧濃度暴露3、7、14天后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數目變化，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡，MTT法評估細胞增殖；通過小RNA干擾將細

3、胞分為轉染組和未轉染對照組，應用MTT法評估兩組細胞的增殖情況，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測兩組細胞的凋亡情況，應用Western blot法檢測mTOR通路上下游主要分子mTOR、4EBP1、P70S6K的蛋白表達情況，應用RT-PCR檢測mTOR通路上下游主要分子mTORC1、4EBP1、P70S6K的基因水平，了解早產鼠肺成纖維細胞在氧化性細胞損傷和修復中的作用及mTOR信號通路機制；將細胞分為90%氧濃度組、轉

4、染組、90%氧濃度+雷帕霉素組和對照組，應用ELISA法檢測細胞外基質Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的水平，應用Western blot法檢測凋亡相關基因bcl-2和P53的蛋白表達情況，應用Western blot法檢測促纖維化因子CTGF和TGF-β的蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.高濃度氧干預的結果
　　a.高氧暴露后L929細胞增殖活性減弱，且隨著氧濃度和氧暴露時間的延長L929細胞增殖活性減弱越明顯，與空氣對

5、照組比較具統(tǒng)計學差異(P<0.05)；高氧暴露后抑制細胞增殖，抑制率隨氧濃度和暴露時間延長而增加。
　　b.高氧暴露后加速L929細胞凋亡壞死，隨著氧濃度和氧暴露時間的延長L929細胞凋亡率增加，與空氣對照組比較具統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　c.高氧暴露后細胞胞體折光率降低，胞漿內顆粒物質增多，細胞生長不均勻，狀態(tài)欠佳，細胞數量隨氧濃度和氧暴露時間的延長而減少。
　　2.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后的結果

6、　　a.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后L929細胞增殖活性明顯減弱，且隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長L929細胞增殖活性減弱越明顯，與空氣+雷帕霉素組比較具顯著性差異(P<0.01)；60%的高氧暴露后增殖抑制更明顯；雷帕霉素和高濃度氧共同干預后可抑制細胞增殖，其抑制率隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長而增加。
　　b.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后加速L929細胞凋亡壞死，隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長 L929細

7、胞凋亡率增加，與空氣對照組比較具統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　c.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后細胞胞體折光率降低，胞漿內顆粒物質增多，細胞生長不均勻，狀態(tài)欠佳，細胞數量隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長而減少。
　　3.mTORsiRNA干擾對L929細胞增殖、凋亡及mTOR信號通路上下游分子的蛋白和mRNA表達結果
　　a.mTORsiRNA干擾后轉染組mTORC1、P70S6K和4EBP1的蛋白表達下降，與非

8、轉染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　b.mTORsiRNA干擾后轉染組mTORC1、P70S6K和4EBP1的mRNA表達下降，與非轉染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　c.mTORsiRNA干擾后轉染組L929細胞增殖活性減弱，與非轉染組比較有顯著性差異(P<0.01)；mTORsiRNA干擾后抑制L929細胞增殖，其抑制率為26.71%。
　　d.mTORsiRNA干擾后可加速L929細胞凋亡，與

9、與非轉染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　4.高濃度氧、雷帕霉素及mTORsiRNA干預對L929細胞外基質影響的結果
　　a.與空氣對照相比，90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組肺成纖維細胞的細胞外基質中col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN均有升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與空氣對照組相比，轉染組的col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　b.與空氣對照相比，90%高氧組、

10、90%高氧+雷帕霉素組、轉染組肺成纖維細胞的bcl-2蛋白表達減少，P53蛋白表達增加，差異有顯著性(P<0.01)。
　　c.與空氣對照組相比，90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組的CTGF和TGF-β蛋白表達均升高，轉染組的CTGF和TGF-β蛋白表達均下降，差異有顯著性(P<0.01)；
　　結論：
　　1.單純高濃度氧作用于體外培養(yǎng)的早產鼠肺成纖維細胞時， 可抑制其增殖，加速凋亡。
　　2.雷帕霉

11、素可抑制早產鼠肺成纖維細胞增殖，加速凋亡，其可能的機制是通過mTOR信號通路。
　　3.mTORsiRNA可抑制早產鼠肺成纖維細胞增殖，加速凋亡。
　　4.雷帕霉素、mTORsiRNA抑制早產鼠肺成纖維細胞增殖的可能機制是通過mTOR信號通路，特異性地抑制早產鼠肺成纖維細胞中mTORC1、4EBP1和P70S6K蛋白及mRNA的表達。
　　5.90%濃度高氧、雷帕霉素均可促進高氧暴露后早產小鼠肺成纖維細胞的col-Ⅰ、

12、col-Ⅲ和FN增多，阻斷其增多的可能機制是通過mTOR信號通路的調節(jié)。
　　6.Bcl-2是抗凋亡因子，可抑制肺成纖維細胞凋亡；P53是促凋亡因子，可促進肺成纖維細胞凋亡。90%濃度高氧、雷帕霉素、mTORsiRNA轉染均可促進肺成纖維細胞凋亡。
　　7.CTGF和TGF-β在氧化細胞損傷BPD肺纖維化時促纖維化作用的可能機制是通過mTOR信號通路，即mTOR信號通路通過促進CTGF和TGF-β的表達促進早產鼠肺成纖維細胞