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文檔簡(jiǎn)介
1、眼睛把光投射到視網(wǎng)膜感受器并轉(zhuǎn)化成電信號(hào)沖動(dòng),通過(guò)視神經(jīng)傳遞到腦部而形成視覺。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinaganglioncells,RGCs)的軸突形成視神經(jīng),而視神經(jīng)損傷是視力喪失的原因之一。雖然視神經(jīng)損傷在視力喪失中僅占一小部分比例,但其造成的視力損害是不可逆的。研究表明視神經(jīng)受損后無(wú)法再生,其主要原因是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷后軸突缺乏再生能力以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逆行退化導(dǎo)致節(jié)細(xì)胞凋亡。在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)軸突再生失敗已被證實(shí)主
2、要是由于存在內(nèi)源性抑制劑抑制軸突再生,這些抑制劑包括Nogo-A、髓鞘相關(guān)性糖蛋白(Myelin-associatedglycoprotein,MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte-myelinglycoprotein,OMGP)等。在這些內(nèi)源性的抑制劑當(dāng)中,Nogo-A一直備受關(guān)注。Nogo-A是髓磷脂來(lái)源的抑制劑,包括兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:Nogo-66和Nogo氨基末端結(jié)構(gòu)域。不同的結(jié)構(gòu)域可與不同的受體結(jié)合發(fā)
3、揮不完全相同的生物學(xué)功能,Nogo-66與其受體(Nogo-66receptor,NgR)結(jié)合發(fā)揮雙重作用,既抑制軸突再生,又在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)、導(dǎo)向和塑形,而Nogo氨基末端只發(fā)揮抑制作用。Nogo氨基末端是否能夠抑制視神經(jīng)再生及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。
整合素是一種細(xì)胞表面糖蛋白,由非共價(jià)鍵連接的α和β兩個(gè)亞單位形成異二聚體復(fù)合物。整合素銜接細(xì)胞外基質(zhì)的配體,形成粘附復(fù)合物,為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架提供耦合,
4、這對(duì)細(xì)胞的擴(kuò)展、促進(jìn)生長(zhǎng)錐向遠(yuǎn)端的生長(zhǎng)都是必須的。Nogo氨基末端通過(guò)整合素抑制細(xì)胞粘附和軸突生長(zhǎng)。整合素αv和整合素α5廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng),Nogo氨基末端是否通過(guò)整合素αv和(或)整合素α5信號(hào)通路在視神經(jīng)軸突生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步研究。
本課題主要進(jìn)行了以下三個(gè)方面的研究:
1、觀察Nogo氨基末端信號(hào)通路在視覺神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況。
2、證實(shí)Nogo氨基末端對(duì)于視神經(jīng)再生修復(fù)具有抑制作用。
5、
3、證實(shí)Nogo氨基末端通過(guò)整合素αv信號(hào)通路,而不是α5信號(hào)通路發(fā)揮抑制作用。
目的:
證實(shí)Nogo氨基末端對(duì)于視神經(jīng)再生具有抑制效應(yīng)且其通過(guò)整合素信號(hào)通路發(fā)揮作用,為治療視神經(jīng)損傷提供新的策略,同時(shí)也為中樞神經(jīng)損傷修復(fù)研究提供借鑒和參考。
方法:
采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)整合素αv、整合素α5和成簇黏附激酶(focaladhesionkinase,FAK)蛋白的表達(dá),體外篩選針對(duì)大
6、鼠Nogo-A的小分子干擾RNA序列,重組腺相關(guān)病毒包轉(zhuǎn)和純化。原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV2/8-NC-siRNA,rAAV2/8-Nogo-A-siRNA,Nogo-66競(jìng)爭(zhēng)拮抗劑(Nep1-40)和Nogo氨基末端功能片段(△20)刺激,Thy-1免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突長(zhǎng)度。建立視神經(jīng)鉗夾傷模型,玻璃體腔注射PBS,rAAV2/8-NC-siRNA,rAAV2/8-Nogo-A-siRNA,Nep1-40和△
7、20,熒光金逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率,GAP-43染色觀察再生視神經(jīng)纖維情況,F-VEP檢測(cè)視神經(jīng)功能。WesternBlot檢測(cè)整合素αv、整合素α5和FAK蛋白的表達(dá)。RhoAG-LISA法檢測(cè)RhoA活性。
主要結(jié)果和結(jié)論如下:
1、免疫組織化學(xué)染色方法證實(shí)整合素αv、整合素α5以及整合素的下游關(guān)鍵分子FAK均可在大鼠的視皮質(zhì)、視網(wǎng)膜以及視神經(jīng)中表達(dá)。這些Nogo氨基末端信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)在視覺通路上,
8、說(shuō)明Nogo氨基末端有可能通過(guò)整合素信號(hào)途徑發(fā)揮作用。
2、Nogo-A靶向siRNA可高效特異的下調(diào)RGCs的Nogo-A的表達(dá),而通用陰性對(duì)照序列對(duì)Nogo-A的表達(dá)無(wú)影響,成功篩選出有效RNAi序列,為本研究中構(gòu)建Nogo-A靶向siRNA重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體提供了實(shí)驗(yàn)前提。Nogo-A靶向siRNA重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體可有效的抑制原代培養(yǎng)的RGCs以及活體動(dòng)物視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的Nogo-A蛋白的表達(dá),且在動(dòng)物體內(nèi)
9、Nogo-A的抑制效應(yīng)于病毒注射后4w即已存在,8w時(shí)仍持續(xù),提示重組腺相關(guān)病毒已成功的整合到RGCs基因組中,從而可以發(fā)揮其長(zhǎng)久RNA干擾作用。
3、體外實(shí)驗(yàn)采用RNAi完全抑制Nogo-A和針對(duì)Nogo-A的部分片段(Nogo-66)的拮抗劑(Nep1-40)均可促進(jìn)RGCs軸突生長(zhǎng),但完全抑制Nogo-A后促生長(zhǎng)作用更強(qiáng),說(shuō)明Nogo-A上尚存在除Nogo-66外的抑制片段,而給予Nogo氨基末端的功能片段△20能夠明顯
10、抑制RGCs軸突生長(zhǎng),證實(shí)Nogo氨基末端即為Nogo-A上除Nogo-66外的抑制片段。
4、在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn),熒光金逆行標(biāo)記觀察RGCs存活率,發(fā)現(xiàn)Nogo氨基末端對(duì)RGCs存活的抑制作用,通過(guò)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associattedprotein43,GAP-43)免疫熒光組織化學(xué)染色觀察視神經(jīng)鉗夾傷后視神經(jīng)再生情況證實(shí)Nogo氨基末端抑制神經(jīng)再生修復(fù);F-VEP檢測(cè)證明Nogo氨基末端不利于視神經(jīng)功能的恢復(fù),
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