我國中部農(nóng)村HIV-1耐藥性及分子進(jìn)化規(guī)律研究.pdf

1、本研究通過對河南省部分地區(qū)接受規(guī)范性抗病毒治療的患者進(jìn)行隊列研究，闡明抗病毒治療后HIV-1耐藥性的流行狀況、揭示耐藥突變的發(fā)生和演變規(guī)律，以及耐藥性對抗病毒治療效果的影響。 第一部分我國中部農(nóng)村HIV-1耐藥發(fā)生和演變的隊列研究從2004年3月開始對河南省某地76名接受免費(fèi)抗病毒治療的艾滋病患者進(jìn)行前瞻性隊列研究，該隊列的抗病毒治療方案為兩種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑加一種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。治療期間共隨訪6次，隨訪時間2.5年

2、。每次隨訪均進(jìn)行抗病毒治療相關(guān)的問卷調(diào)查，并采集外周靜脈血進(jìn)行CD4<'+>T淋巴細(xì)胞計數(shù)、病毒載量測定和基因型耐藥性檢測。6次隨訪共收回調(diào)查問卷427份，采集EDTA抗凝血427份。通過隨訪表的統(tǒng)計分析獲得病人的人口統(tǒng)計學(xué)特征、藥物副反應(yīng)和服藥依從性；通過CD4<'+>T細(xì)胞計數(shù)和病毒載量了解患者病毒抑制和免疫功能恢復(fù)情況；通過基因型耐藥性結(jié)果了解耐藥突變的特征和對藥物的敏感程度。將6次的結(jié)果對比研究，闡明HIV-1耐藥性的流行情況，

3、揭示HIV-1耐藥性的發(fā)生和演變規(guī)律。 主要結(jié)果如下： A．在隨訪過程中，至少對一種藥物產(chǎn)生耐藥的患者比例高達(dá)78.9％。首次發(fā)生耐藥的時間集中在抗病毒治療開始后的18個月內(nèi)。 B．研究隊列在隨訪期間對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥流行率在6.6～23.7％之間，對非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥流行率在13.2～42.1％之間。對兩類藥物耐藥的流行率呈總體上升趨勢。 C．在隨訪期間共出現(xiàn)17個與NRTIs耐藥有

4、關(guān)的突變位點(diǎn)。其中包括胸苷類耐藥突變：M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y、K2190：0151M突變復(fù)合體：V75I、F77L、F116Y和Q151M；T69S-SS插入突變；因ddI治療產(chǎn)生的K65E、L74V、M184V/I等突變，以及E44D、V118I等其他次要耐藥突變位點(diǎn)。TAMs是導(dǎo)致NRTIs耐藥的主要突變位點(diǎn)，在整個治療過程中呈總體上升趨勢。其他突變位點(diǎn)發(fā)生頻率較低，持續(xù)時間較短。與NNRTIs耐藥有關(guān)

5、的突變位點(diǎn)共有15個。最主要的3個耐藥突變位點(diǎn)是：K103N、Y181C和G190A，這3個突變的發(fā)生頻率較高，并呈持續(xù)上升的趨勢。 D．耐藥人群對AZT的耐藥以中、高度耐藥為主，對ddI以低度耐藥為主，對NVP以高度耐藥為主。對AZT和ddI耐藥的患者同時對NRTIs類中的ABC、d4T、TDF也產(chǎn)生了交叉耐藥，攜帶V184V/I突變的患者對3TC和FTC產(chǎn)生了低度耐藥性。對NVP高度耐藥的患者對NNRTIs類的其他兩種藥物D

6、LV和EFV也產(chǎn)生了高度耐藥性。28.9％的患者同時對NRTIs和NNRTIs兩類藥物產(chǎn)生了多重耐藥性。 E．服藥依從性是耐藥發(fā)生的主要影響因素。依從性和耐藥發(fā)生率的關(guān)系在治療前、后期呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。在治療前期，依從性和耐藥的發(fā)生率呈“鐘形”曲線關(guān)系，即服藥依從性好和差的患者耐藥發(fā)生率均很低，服藥依從性中等的患者耐藥發(fā)生的幾率最高。在治療后期，依從性差的患者耐藥發(fā)生率依然較低，而依從性好和中等的患者發(fā)生耐藥的幾率都很高。

7、 F．治療30個月時所有患者的CD4<'+>T細(xì)胞計數(shù)均值較治療3個月時降低了215 cells/ml。病毒載量對數(shù)均值下降了0.2 log copies/ml。在整個治療過程中，對藥物敏感患者CD4<'+>T細(xì)胞計數(shù)均值與耐藥患者沒有顯著性差異。耐藥患者的病毒載量對數(shù)均值顯著高于敏感患者。 G．治療過程中，耐藥患者的平均HIV RT基因離散率顯著高于敏感患者和中斷治療患者。攜帶的耐藥突變越多，基因離散率越高。 第二部

8、分 HIV-1耐藥性的選擇動力學(xué)研究以耐藥研究隊列中4名服藥依從性較好，在治療初期為野生型毒株，在以后的治療過程中逐漸發(fā)生NRTIs和NNRTIs雙重耐藥突變的患者為研究對象，對每位患者4～5次隨訪血漿樣本的RT基因進(jìn)行克隆分析。每個樣本挑取150～250個克隆進(jìn)行序列測定，逐一對每個序列進(jìn)行分析和整理，將最終獲得的855個克隆的序列與斯坦福大學(xué)HIV-1耐藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得所有克隆序列的基因型耐藥性特征。通過對每個患者不同治療時間

9、所有克隆的基因型特征進(jìn)行分析研究，闡明NRTIs和NNRTIs類耐藥突變發(fā)生的選擇動力學(xué)特征，揭示我國HIV-1耐藥毒株進(jìn)化演變的規(guī)律。 主要結(jié)果如下： A．NRTIs類耐藥突變是一個逐級累加的過程。在所選的4例患者中，NRTIs類耐藥突變表現(xiàn)出三種不同的發(fā)生演變途徑： 一是TAMs-1型，從野生型開始逐個累加TAMs-1的典型耐藥突變，先形成以M41L,L210W,T215Y為主的TAMs典型耐藥突變組合，之后

10、繼續(xù)累加次要耐藥位點(diǎn)，最終在治療30個月時形成攜帶6個TAMs-1的突變形式。 二是TAMs-2型，治療3個月時從D67N,K70R突變開始累加其他耐藥突變，治療24個月時形成D67N,K70R，K219Q的典型TAMs-2突變位點(diǎn)組合。之后繼續(xù)累加其他突變位點(diǎn)，形成更復(fù)雜的TAMs-2突變形式。 三是TAMs-1和TAMs-2融合型：首先在治療12個月時分別形成M41L，T215Y的TAMs-1突變和D67N，K70R

11、的TAMs-2突變，治療30個月時二者加合為M41L，T215Y，D67N，K70R的TAMs-1和TAMs-2組合突變形式。 B．NNRTIs類耐藥突變的演變規(guī)律為：最先出現(xiàn)的突變形式往往就是最終的優(yōu)勢種。4例患者包括四種不同的耐藥突變演變途徑： 一是G190A：治療3個月時出現(xiàn)G190A突變，治療18個月時發(fā)展為G190A，F(xiàn)227L突變組合，之后出現(xiàn)G190A，F(xiàn)227L，P236V三位點(diǎn)突變。 二是Y18

12、8C：治療3個月時即出現(xiàn)Y188C突變并持續(xù)至隨訪結(jié)束。 三是V179D，Y181C：治療3個月時即出現(xiàn)V179D，Y181C突變，隨訪結(jié)束時演變?yōu)閂179D，Y181C，P236V。 四是治療24個月前為野生型，治療后期出現(xiàn)以K103N，M230L或K103N，Y181C為主要突變的耐藥突變。 第三部分 HIV-1耐藥性毒株的復(fù)制適應(yīng)性研究為了在統(tǒng)一的基因背景下研究耐藥突變對病毒復(fù)制適應(yīng)性的影響，本研究首先利用

13、對藥物敏感的HIV-1傳代株分別誘導(dǎo)3TC耐藥株和NVP耐藥株。將兩耐藥毒株分別與野生株在加藥和不加藥的環(huán)境中共同培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4代，利用Taqman MGB探針通過實時定量RT-PCR技術(shù)檢測每代培養(yǎng)物中耐藥株和野生株RNA的相對比例，通過該比例隨培養(yǎng)時間的變化趨勢來評價耐藥株和野生株的相對復(fù)制適應(yīng)性。 主要結(jié)果如下： A．在實驗室分別用兩種策略誘導(dǎo)成功我國第一株NRTIs耐藥株和第一株NNRTIs耐藥株。3TC耐藥株

14、半數(shù)抑制濃度>2mM，與野生株相比提高了11萬倍以上；NVP耐藥株IC<,50>>1mM，與野生株相比提高了3萬倍以上。 B．在加藥的培養(yǎng)系統(tǒng)中，用等量的耐藥株與野生株共同培養(yǎng)4代，從第1代到第4代，3TC耐藥株RNA．拷貝數(shù)占培養(yǎng)系統(tǒng)全部拷貝數(shù)的比例從76.2％增加至98.8％，而野生株則從23.8％下降至1.2％；NVP耐藥株占培養(yǎng)系統(tǒng)全部拷貝數(shù)的比例從62.0％增加至90.5％，野生株則從38.0％下降至9.5％。表明在加

15、藥的培養(yǎng)系統(tǒng)中兩種耐藥株的復(fù)制適應(yīng)性均高于野生株。 C．在不加藥的培養(yǎng)系統(tǒng)中，用等量的耐藥株與野生株共同培養(yǎng)4代，從第1代到第4代，3TC耐藥株RNA拷貝數(shù)占培養(yǎng)系統(tǒng)全部拷貝數(shù)的比例從35.2％下降至5.3％，而野生株則從64.8％上升至94.7％，表明在加藥的培養(yǎng)系統(tǒng)中，3TC耐藥株的復(fù)制能力比野生株弱；NVP耐藥株占培養(yǎng)系統(tǒng)全部拷貝數(shù)的比例從53.9％增加至75.0％，野生株則從46.1％下降至25.0％。表明在加藥的培養(yǎng)系

16、統(tǒng)中NVP耐藥株的復(fù)制能力比野生株強(qiáng)。 第四部分我國HIV-1 B亞型流行株表型耐藥性研究表型耐藥性檢測方法是利用體外藥敏分析方法對HIV-1耐藥性進(jìn)行的直接評價。我國目前對HIV-1耐藥性的研究普遍采用的是基因型耐藥性檢測方法，從未對HIV-1臨床分離株的表型耐藥性進(jìn)行過研究，也未對基因型耐藥性檢測結(jié)果與表型檢測結(jié)果的符合程度進(jìn)行過專門研究。在本研究中，我們選擇了8株HIV-1臨床分離株，對其基因型和表型耐藥性進(jìn)行了檢測。

17、 主要結(jié)果如下： A．經(jīng)過表型耐藥性檢測，待測毒株對AZT的IC<,50>在0.0006～0.1300μmol/1之間，與敏感株相比，IC<,50>的倍數(shù)變化在0.1～26.0之間；待測毒株對3TC的IC<,50>在0.0016～0.0390μmol/l之間，與敏感株相比，IC<,50>的倍數(shù)變化在0.5～11.5之間；待測毒株對NVP的IC<,50>在0.0104～0.4234gmol/l之間，與敏感株相比，IC<,50>