乙型肝炎病毒基本核心啟動(dòng)子-前核心區(qū)和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異的臨床特點(diǎn)與意義研究.pdf

1、研究背景:乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染可引起多種臨床表現(xiàn),包括無(wú)癥狀HBV攜帶狀態(tài)、急性乙型肝炎、輕中度或重度慢性乙型肝炎,并可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌和慢加急性肝衰竭。我國(guó)有9300萬(wàn)慢性HBV感染者,其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)人,乙肝肝硬化患者約400萬(wàn)人,每年約28萬(wàn)人死于肝細(xì)胞癌。而慢加急性肝衰竭患者每年可造成2萬(wàn)多人死亡,其發(fā)生與機(jī)體對(duì)感染病毒產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答相關(guān),而病毒基因變異可能

2、是引起機(jī)體免疫應(yīng)答異常的一個(gè)重要因素。
　　HBV具有高變異特性,雖是DNA病毒,其復(fù)制卻與逆轉(zhuǎn)錄病毒類(lèi)似存在一個(gè)RNA中間體的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程,而參與此過(guò)程的HBVDNA多聚酶/逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)缺乏嚴(yán)格的校對(duì)功能,使病毒復(fù)制過(guò)程中的堿基錯(cuò)配率明顯高于其他DNA病毒。HBV也是高復(fù)制率病毒,每天病毒基因組中每個(gè)堿基都有發(fā)生所有堿基替換的可能。此外,HBV的復(fù)制模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(coval

3、ently closed circular DNA,cccDNA)半衰期長(zhǎng),穩(wěn)定存在于感染的肝細(xì)胞核中,是HBV持續(xù)感染的根本原因。在自然感染狀態(tài)下HBV是以野生株為優(yōu)勢(shì)株的準(zhǔn)種群形式存在,根據(jù)HBV基因組序列差異分為8種不同的基因型(≥8％)和若干基因亞型(≥4%)。各種基因型HBV的病毒學(xué)特點(diǎn)不同,也可影響肝病的臨床轉(zhuǎn)歸。
　　HBV基因組最常見(jiàn)的熱點(diǎn)變異是基本核心啟動(dòng)子(basal core promoter,BCP)區(qū)和前

4、核心(precore,PC)區(qū)變異。HBVPC區(qū)編碼的e抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg)是一種免疫耐受抗原,而B(niǎo)CP區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)HBeAg表達(dá),發(fā)生在這兩個(gè)區(qū)的變異可終止或減低HBeAg表達(dá),增強(qiáng)病毒復(fù)制力或逃避宿主免疫應(yīng)答。另一方面,由于HBeAg與HBV核心抗原(HBcAg)共有相同的免疫表位,該區(qū)變異也增加了免疫系統(tǒng)對(duì)HBcAg的攻擊,可能與乙肝進(jìn)展及重癥化相關(guān)。研究表明HBVBCP/PC區(qū)變異可能與急性

5、重型肝炎的發(fā)生相關(guān),但也有不同的研究結(jié)果?；蛐陀挚梢杂绊態(tài)CP/PC區(qū)變異的發(fā)生率,增加結(jié)果分析的復(fù)雜性。關(guān)于HBVBCP/PC變異和基因型與慢加急性肝衰竭發(fā)生的相關(guān)性分析少見(jiàn)報(bào)道。本研究的第一部分系統(tǒng)分析了我國(guó)臨床大樣本急性乙肝、輕中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者的BCP/PC區(qū)變異和基因型特點(diǎn)以及臨床意義,結(jié)果有助于理解HBV病毒學(xué)特點(diǎn)在乙型肝炎慢性化、重癥化機(jī)制中的作用。
　　當(dāng)前,核苷(酸)類(lèi)似物是臨床最常用的

6、抗HBV感染治療藥物,包括三種核苷類(lèi),即拉米夫定(lamivudine,LAM)、恩替卡韋(entecavir,ETV)和替比夫定(tebivudine,LdT),兩種核苷酸類(lèi),即阿德福韋酯(adefovir dipivoxil,ADV)和富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF),前四種已在我國(guó)臨床批準(zhǔn)使用。這些藥物通過(guò)直接靶向HBVRT區(qū)而發(fā)揮抗病毒作用,但均不能從根本上清除感染肝細(xì)胞核中

7、持續(xù)存在的HBVcccDNA,一旦停藥反跳率高,因此需要長(zhǎng)期抗病毒治療。
　　然而長(zhǎng)期抗病毒治療會(huì)使病毒在藥物壓力下獲得適應(yīng)性變異或使預(yù)存于準(zhǔn)種群中的極少量變異株獲得選擇性擴(kuò)增,產(chǎn)生耐藥病毒導(dǎo)致治療失敗,成為臨床面臨的棘手問(wèn)題。發(fā)生在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的耐藥變異分為直接降低藥物敏感性的原發(fā)耐藥變異和增強(qiáng)病毒復(fù)制力的補(bǔ)償變異,還有一些與ADV耐藥相關(guān)的有爭(zhēng)議的變異。隨著臨床上可選擇的藥物增多,耐藥及交叉耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增加,變異形式也更加多

8、樣化。此外,不適當(dāng)?shù)暮塑?酸)類(lèi)藥物序貫使用促進(jìn)了多重耐藥病毒株的產(chǎn)生。
　　已有的關(guān)于耐藥變異病毒的研究大多來(lái)源于一些臨床試驗(yàn)研究,用藥方式相對(duì)固定,研究的樣本量有限,但實(shí)際上臨床用藥方式復(fù)雜,引起的HBV耐藥變異譜有其特有規(guī)律,以往尚缺少大樣本分析數(shù)據(jù)。本研究的第二部分系統(tǒng)分析了我國(guó)大樣本經(jīng)核苷(酸)類(lèi)藥物治療的慢性HBV感染者HBV基因耐藥譜,并對(duì)1例我們新鑒定的針對(duì)LAM、ADV和ETV的新型多重耐藥HBV變異株的臨床演變

9、特點(diǎn)和感染的臨床治療進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果為全面了解我國(guó)臨床實(shí)際治療中的HBV耐藥譜提供新的信息,對(duì)于幫助我國(guó)HBV耐藥管理的規(guī)范化具有重要意義。
　　目的:
　　(1)分析臨床較大樣本急性乙肝、輕中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者HBV基因型和BCP/PC區(qū)變異特點(diǎn),揭示HBV基因型和BCP/PC區(qū)變異在不同病程HBV感染患者的表現(xiàn)特點(diǎn)和與疾病進(jìn)展的相關(guān)性。
　　(2)分析臨床較大樣本慢性HBV感染者RT區(qū)多位點(diǎn)

10、核苷(酸)類(lèi)似物耐藥相關(guān)變異及其臨床意義,揭示我國(guó)臨床HBV耐藥發(fā)生頻率、四種核苷(酸)類(lèi)似物基因型耐藥變異特點(diǎn)及多重耐藥HBV變異株的演變特點(diǎn)和感染的臨床治療策略。
　　方法:
　　(1)收集182例急性乙肝、325例輕中度慢乙肝、170例重度慢乙肝和298例慢加急性肝衰竭患者血清。提取HBVDNA,應(yīng)用單管巢式聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),擴(kuò)增HBVRT(含S)基因和BCP/

11、PC區(qū)基因,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。根據(jù)RT/S區(qū)序列用MEGA4軟件進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)分析確定HBV基因型,用VectorNTI軟件比對(duì)分析文獻(xiàn)報(bào)道的具有(潛在)臨床意義的10個(gè)位點(diǎn)的核苷酸變異,包括BCP區(qū)1753、1754、1758、1762、1764、1766和1768位點(diǎn)變異和PC區(qū)的1862、1896和1899位點(diǎn)變異。
　　(2)收集1803例經(jīng)核苷(酸)類(lèi)似物長(zhǎng)期治療的慢性HBV感染患者血清,擴(kuò)增HBVRT區(qū)全長(zhǎng)基因

12、,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序,分析rt80、rt84、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt214、rt215、rt217、rt233、rt236和rt250共15個(gè)位點(diǎn)的耐藥相關(guān)變異特點(diǎn)。并進(jìn)一步對(duì)1例新型多重耐藥HBV感染患者系列血清樣本的耐藥變異及HBVDNA載量、轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)合克隆測(cè)序(>20個(gè)克隆/樣本/時(shí)間

13、點(diǎn))結(jié)果,分析多重耐藥HBV株的動(dòng)態(tài)演變規(guī)律、表型耐藥特點(diǎn)和感染的臨床治療策略。
　　結(jié)果:
　　(1)急性乙肝患者HBVB基因型與C基因型比例和BCP/PC區(qū)野生株比例顯著高于慢性乙肝患者。急性乙肝患者HBVBCP區(qū)A1762T、G1764A和前C區(qū)G1896A、G1899A的檢出率顯著低于慢性乙肝患者,但BCP區(qū)T1758C的檢出率卻顯著高于慢性乙肝患者,且T1758C變異與A1762T/G1764A變異有相互排斥傾向。

14、與C基因型HBV相比,B基因型HBVBCP區(qū)變異頻率更低,PC區(qū)變異頻率相似。在含四種基本BCP/PC變異模式的急性乙肝患者間ALT水平相似,而含PC區(qū)變異的慢性乙肝患者ALT水平更高;含有BCP/PC區(qū)雙變異的急性乙肝患者HBVDNA載量更高,而相應(yīng)的慢性乙肝患者HBVDNA載量更低;急性乙肝患者的HBeAg陰性率高于慢性乙肝患者,且BCP/PC區(qū)雙變異的急性乙肝患者HBeAg陰性率更高,而慢性乙肝患者隨著B(niǎo)CP/PC區(qū)變異的累積HB

15、eAg陰性率呈逐級(jí)增高趨勢(shì)。
　　(2)與慢性乙肝患者相比,慢加急性肝衰竭患者HBVBCP區(qū)T1753C/A/G、A1762T、G1764A、C1766T變異頻率和前C區(qū)G1862T、G1896A、G1899A變異頻率顯著增高。而且,A1762T/G1764A雙聯(lián)變異和G1896A熱點(diǎn)變異頻率以及10個(gè)分析位點(diǎn)的平均堿基替代數(shù)目隨著疾病進(jìn)展(輕中度慢乙肝<重度慢乙肝<慢加急性肝衰竭)逐級(jí)增高。與C基因型HBV相比,B基因型HBV的

16、BCP區(qū)變異頻率明顯降低,而PC區(qū)變異頻率明顯增高。與HBVBCP區(qū)變異不同的是,在上述三種疾病類(lèi)型中HBVPC區(qū)變異均顯著影響HBeAg向抗HBe的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。此外,感染了PC變異株的慢加急性肝衰竭患者比感染了PC野生株的患者病死率明顯增高。
　　(3)1803例患者中有560例檢出耐藥相關(guān)變異,其中214例來(lái)自490例接受LAM單一治療的患者,35例來(lái)自428例接受ADV單一治療的患者,5例來(lái)自18例接受LdT單一治療的患者以

17、及306例來(lái)自794例接受序貫或聯(lián)合抗病毒治療的患者,而在73例接受ETV單一治療的患者中未檢出耐藥變異。381例接受LAM耐藥后換成ADV繼續(xù)治療患者中有36例(9.4%)檢出ADV耐藥變異,而LAM耐藥后加用ADV繼續(xù)治療的82例患者中僅1例(1.2%)檢出ADV耐藥變異。ETV耐藥變異不僅在LAM和ETV經(jīng)治的患者中檢出,而且在LAM單一治療的患者中也檢出。tL180M+rtM204I雙變異株檢出頻率在C基因型HBV較B基因型HB

18、V更常見(jiàn),并且感染了此種雙變異株的患者ALT水平明顯高于感染了rtM204I單一變異HBV株的患者。值得注意的是,在8例患者中檢出多重耐藥HBV變異株。
　　(4)我們對(duì)1例新型多重耐藥HBV變異株感染的慢乙肝患者進(jìn)行隨訪,該患者自2002年6月起先后序貫接受了長(zhǎng)達(dá)116個(gè)月的抗病毒治療,即10個(gè)月的LAM與干擾素-α2b聯(lián)合治療、23個(gè)月的LAM單一治療、13個(gè)月的ADV單一治療、12個(gè)月的ETV單一治療、12個(gè)月的ADV與干擾

19、素-α2b聯(lián)合治療、6個(gè)月的ADV單一治療、40個(gè)月的ADV加用LAM聯(lián)合治療。目前HBVDNA維持檢測(cè)不到水平,ALT水平正常?？寺y(cè)序顯示病毒準(zhǔn)種池中多重耐藥HBV株的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程,即由最初的野生株,LAM耐藥株rtM204I,ADV耐藥株rtA181V和rtA181T,LAM耐藥株rtL180M+rtM204V,ETV耐藥株rtL180M+rtS202G+rtM204V,ADV耐藥株rtN236T±rtA181T,多重耐藥株rtL

20、180M+rtA181V+rtS202G+rtM204V+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V+rtN236T,到ETV耐藥株rtL180M+rtS202G+rtM204V。
　　結(jié)論:
　　(1)感染了B基因型HBV、BCP/PC區(qū)野生型HBV、BCP區(qū)T1758C變異型HBV更易發(fā)展為急性乙肝,而慢性乙肝的發(fā)生與BCP/PC區(qū)變異的累積密切相關(guān)。
　　(2)HBVBCP/PC區(qū)變異與慢性乙

21、肝的疾病進(jìn)展呈正相關(guān),BCP/PC區(qū)變異HBV感染的慢乙肝患者更易發(fā)生重癥肝炎以及慢加急性肝衰竭,具有PC變異株的慢加急性肝衰竭患者具有更高死亡風(fēng)險(xiǎn)。
　　(3)雖然僅四種核苷(酸)類(lèi)藥物在我國(guó)臨床使用,臨床上實(shí)際抗病毒治療組合方案多達(dá)40余種,HBV耐藥變異形式也復(fù)雜多樣,長(zhǎng)期不規(guī)范用藥促進(jìn)了耐藥及多重耐藥HBV變異株的產(chǎn)生,為治療帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。HBV基因型耐藥譜的數(shù)據(jù)分析對(duì)于我國(guó)乙肝耐藥管理具有重要臨床意義。
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