逆轉錄酶抑制劑膦甲酸鈉用于治療乙型肝炎病毒感染的理論與實踐.pdf

1、具有逆轉錄特征的生物酶廣泛存在于乙型肝炎病毒(HBV)、人類T淋巴細胞病毒(HTLV)、鼠乳腺癌病毒(MMTV)、人類自身免疫缺陷病毒(HIV)、花椰菜花葉病毒(CaMV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等多種動植物病毒中，它們對人類的自身健康和生產(chǎn)生活產(chǎn)生了巨大的不良影響。針對逆向轉錄酶(RT)的藥物研究具有廣泛的重要意義。通常情況下，藥物研發(fā)過程必須要設計出適合于高通量篩選的靶位模型。傳統(tǒng)的RT活性的3H摻入檢測法由于其操作過程復雜和放射性

2、核素使用方面固有的缺陷，已不能滿足當前的需要，而且難以發(fā)展成為高通量或半高通量的篩選技術。 在國內(nèi)首次構建了RT活性的ELISA檢測法，應用預先包被于Covalink96孔板的poly(A)模板和不同來源的RT將生物素標記的dUTP摻入，用辣根過氧化物酶反應系統(tǒng)檢測酶活性，在一定時間范圍內(nèi)，反映酶活性的OD值的大小與時間呈線性關系。通過與放射性核素摻入檢測法進行比較，顯示兩種方法有明顯的一致性(HIV-1RT：r2=0.997)。

3、應用ELISA法檢測奈韋拉平(NVP)、膦甲酸鈉(PFA)對HIV-1RT活性的抑制作用，顯示出藥物作用的劑量依賴性，測得IC50分別為0.23±0.12g/ml、0.21±0.08g/ml。同時，對ELISA法的重復性、穩(wěn)定性及用于抑制劑研究的特異性和敏感性進行了評價，證明了應用ELISA法檢測HIV-1RT的活性具有簡便、快速、重復性好、特異性強的特點，適用于抗HIV-1RT藥物的大樣品量篩選工作，并可發(fā)展成為高通量技術。在成功構建

4、HIV-1RTELISA檢測方法的基礎上，利用該方法，進一步檢測了莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(M-MLV-RT)、禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMV-RT)及鴨乙型肝炎復制復合體(DHBVRCs)的活性，同時還檢測了HIV-1感染細胞上清中RT的活性，證明ELISA法適用于具有逆轉錄特征的多種病毒酶的體外活性檢測。 隨著高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)在艾滋病患者中的廣泛應用，抗HIV感染的聯(lián)合化療取得了極大成功，HIV的傳播

5、得到了一定程度的控制，最新的研究表明，僅僅聯(lián)合使用兩個RT抑制劑如齊多夫定(AZT)和奈韋拉平(NVP)亦可使患者血液中HIV滴度降至檢測不到的水平。然而，HBV感染的治療卻面臨著相當?shù)睦Ь常?)與抗HIVRT的藥物相比，可供選擇抗HBVRT的治療藥物十分有限；2)伴隨某種藥物的長期單一應用，耐藥病毒株不斷出現(xiàn)。尋找新的不同機制的抗HBV藥物，增加聯(lián)合用藥的候選藥物種類，是目前亟待解決的問題。 因此，在成功構建RT活性的ELIS

6、A檢測法的基礎上，對多種RT抑制劑進行了研究，其中RT抑制劑膦甲酸鈉(PFA，phosphonoformicacid)及其治療HBV的可能性引起了我們的關注。PFA是膦乙酸(PAA，phosphonoaceticacid)的同類物，是一個人工合成的小分子化合物，分子量300.1，當前在臨床上主要應用于皮膚黏膜單純皰疹病毒(HSV)感染、帶狀皰疹病毒(VZV)感染及免疫缺陷者(如艾滋病患者)發(fā)生的巨細胞病毒(CMV)性視網(wǎng)膜炎。

7、PFA有三個特點不同于抗HBV的傳統(tǒng)RT抑制劑(如3TC)：1)PFA是一個小分子焦磷酸鹽類似物，結構上與核苷類似物3TC不同，2)作用位點是病毒DNA多聚酶的磷酸鹽結合部位，不同于3TC竟爭病毒DNA多聚酶的底物結合位點，3)區(qū)別于3TC，PFA進入細胞內(nèi)即可發(fā)揮抑酶活性，不依靠病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)和/或宿主細胞的激酶激活形成3TC三磷酸化的活性形式。基于對PFA以上特征的高度關注，我們開展了PFA抗HBV感染的研究。

8、本研究的目的是研究PFA應用于HBV感染治療的機制與療效。放射性核素摻入法體外酶抑制實驗顯示，PFA對DHBVDNA多聚酶、HBVDNA聚合酶活性均有抑制作用，抑制曲線均顯示劑量依賴性，IC50分別為1.25±0.04μg/ml、18.70±1.11μg/ml。對于人工轉染HBV全基因組的HepG2細胞(2.2.15細胞)，體外細胞實驗結果顯示，藥物處理細胞9天后，PFA明顯抑制細胞中HBVDNA復制，與細胞對照組相比，細胞中HBVRC

9、-DNA、DS-DNA及HBVDNA總量顯著減少，且PFA的藥效顯示出明顯的劑量依賴性，并可對病毒酶產(chǎn)生直接抑制作用，無需磷酸化過程。 在動物體內(nèi)實驗中，一日齡雛鴨靜脈注射DHBV7天后，PFA腹腔注射給藥，日兩次，用藥14天后，與病毒對照組比較，血清中HBVDNA和鴨乙肝表面抗原(DHBsAg)明顯減少(250mg/kg組，P＜0.01；125mg/kg組，P＜0.05)，鴨肝臟中DHBVDNA復制受到顯著抑制，DS-DNA(

10、250mg/kg組，P＜0.001；125mg/kg組，P＜0.01)和cccDNA(250mg/kg組，P＜0.01；125mg/kg組，P＜0.05)的數(shù)量明顯減少。在鴨乙型肝炎模型中，PFA的藥效亦顯示出明顯的劑量依賴性。 在進一步的研究中，我們將PFA用于治療臨床上不同類型的慢性乙型肝炎患者，患者體內(nèi)HBV負荷明顯下降，病情得到改善。第一組病人為31例未接受過任何抗病毒治療措施的慢性活動性肝炎患者，接受PFA靜脈注射治療

11、，每天1g，日兩次，用藥4周，血液中HBV活動性復制的重要臨床指標HBVDNA下降99.7％(p＜0.05)，HBeAg下降96％(p＜0.01)，同用藥前相比，有顯著性差異。與PFA的抗病毒療效一致，反映肝功能指標的ALT(p＜0.001)，AST(p＜0.001)，γ-GT(p＜0.01)，與用藥前相比，顯著降低，表明患者肝功能明顯改善。第二組為21例由于病毒產(chǎn)生YMDD突變而導致3TC抗藥性的慢性活動性肝炎患者，接受PFA治療28

12、天后，患者血液中HBeAg和HBVDNA與PFA治療前相比，顯著下降(p值小于0.01)，HBV復制水平明顯降低；ALT、AST、γ-GT水平下降，肝功能明顯改善。這些結果與第一組病例相一致。第三組是13例伴有嚴重肝損傷的重癥肝炎的患者，接受PFA治療前一直服用傳統(tǒng)中藥而未接受過3TC治療。經(jīng)過四周PFA治療后，同用藥前相比，血液中HBeAg(p＜0.01)、HBVDNA(p＜0.05)、AST(p＜0.05)、ALT(p＜0.02)的

13、水平顯著下降，黃疸消失，表明患者體內(nèi)乙肝病毒的復制受到明顯抑制，肝功能改善，癥狀減輕。以上三組病例血液中的HBVDNA、HBeAg、ALT、AST均顯著下降，表明HBV的復制得到控制，肝功能改善；而通過對第一組慢性活動性肝炎病例PFA治療前后腎功能指標(尿素氮、血肌酐)的檢測，表明患者腎功能正?；驘o明顯變化。 鑒于已取得的實驗結果以及傳統(tǒng)抗肝炎藥3TC在HBVDNA多聚酶上的作用位點區(qū)別于PFA，我們初步探索了PFA與3TC聯(lián)合

14、進行抗HBV治療的可能性。對于2.2.15細胞，用PFA和3TC聯(lián)合處理細胞，藥物處理細胞9天后，結果顯示，與單獨給藥組相比，兩種藥物劑量比例適當?shù)穆?lián)合給藥組細胞中HBVDNA總量減少更為顯著，明顯優(yōu)于PFA和3TC單獨給藥組，并呈現(xiàn)藥物協(xié)同作用。在DHBV感染雛鴨動物模型中，單獨給藥組動物PFA腹腔注射給藥，3TC灌胃給藥，聯(lián)合給藥組動物同時給予PFA腹腔注射和3TC灌胃，通過檢測鴨肝DHBVDNA含量，發(fā)現(xiàn)兩種藥物劑量比例適當?shù)穆?lián)合

15、給藥組療效更為顯著，與細胞實驗的結論相同，并呈現(xiàn)顯著的藥物協(xié)同作用。 綜上所述，PFA是一個小分子全合成的病毒DNA多聚酶抑制劑，阻斷HBVDNA多聚酶的磷酸鹽結合部位并抑制HBVDNA復制。本研究在體外酶水平、細胞水平、DHBV動物模型體內(nèi)、慢性活動性肝炎患者體內(nèi)四個層面綜合和深入分析了PFA在抗HBV感染方面的理論并嚴格證實了其臨床療效，并展示了其與3TC聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。由此，我們認為，PFA在HBV感染者的治療中，有實