Galectin-7通過(guò)TGFβ-Smad3途徑促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖和向Th1細(xì)胞偏移.pdf

1、第一部分 Galectin-7與急性排斥反應(yīng)及T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)性的研究
　　目的:研究galectin-7在小鼠心臟移植物中的表達(dá)與定位,以及該蛋白在心臟移植受鼠腹部引流淋巴結(jié)中的表達(dá)情況,以探討galectin-7與急性排斥反應(yīng)及T細(xì)胞應(yīng)答的相關(guān)性。
　　方法:建立小鼠腹部心臟移植模型,小鼠異基因(BALB/c→C57BL/6)和同基因(BALB/c→BALB/c)移植心臟分為急排組和對(duì)照組。急排組和對(duì)照組移植心臟分別于術(shù)后

2、3、5、7天獲取。應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)小鼠心臟移植物galectin-7蛋白的表達(dá)情況。Galectin-7在心臟移植物中的定位通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)。無(wú)菌分離心臟移植受鼠腹部引流淋巴結(jié),研磨淋巴結(jié),收集研磨后的液體,并將其制備成單細(xì)胞懸液,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中g(shù)alectin-7蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:我們通過(guò)Westernblot法發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后3、5、7天急排組移植心臟galect

3、in-7的表達(dá)量逐漸增高,且相同時(shí)間點(diǎn)急排組移植心臟galectin-7蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(0·85±0·03vs.0·69±0·05,1·15±0·11vs.0·81±0·02,和2·02±0·12vs.0·81±0·05;P<0·05)。免疫組織化學(xué)染色顯示galectin-7主要定位于急排組移植心臟的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,且該蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中。此外,急排組受鼠腹部引流淋巴結(jié)CD4+galectin-7+T細(xì)

4、胞和CD8+galectin-7+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組(28·0±1·0％vs.1·2±0·2%;12·4±0·8%vs.0·4±0·1%,P<0·01)。
　　結(jié)論:Galectin-7與急性排斥反應(yīng)和T細(xì)胞應(yīng)答有相關(guān)性,并可能發(fā)揮促進(jìn)急性排斥反應(yīng)的作用。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)提示galectin-7可能為急性排斥反應(yīng)提供新的檢測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。
　　第二部分Galectin-7蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和Thl/Th2平衡的

5、影響
　　目的:在功能性抗CD3/CD28抗體不存在或存在的情況下,研究galectin-7蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和Thl/Th2平衡的影響,以探討galectin-7蛋白在T細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程中的作用。
　　方法:分離BALB/c小鼠淋巴結(jié)并通過(guò)碾磨濾過(guò)將其制備成單細(xì)胞懸液,CFSE標(biāo)記目的細(xì)胞。為研究galectin-7蛋白在T淋巴細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用,依據(jù)加入galectin-7蛋白劑量的不同分為:空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組(不同濃度

6、galectin-7蛋白)。另外,為了解在功能性抗CD3/CD28抗體存在的情況下galectin-7蛋白在T淋巴細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用,依據(jù)加入galectin-7蛋白劑量的不同分為:雙抗對(duì)照組(抗CD3/CD28抗體),G7+雙抗組(不同濃度galectin-7蛋白+抗CD3/CD28抗體)。在48孔板中培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞,每孔的T淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×105個(gè),分別加入功能性抗小鼠CD3/CD28抗體、重組小鼠galectin-7蛋白。37

7、℃、5%CO2條件下避光培養(yǎng)5天。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析T淋巴細(xì)胞亞群的增殖。運(yùn)用ELISA法檢測(cè)上清IFN-γ、IL-4的濃度。運(yùn)用熒光定量PCR法檢測(cè)IFN-γ、IL-4mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果:Galectin-7蛋白單獨(dú)作用不具有誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的作用。然而,galectin-7蛋白與功能性抗CD3和抗CD28抗體聯(lián)合作用誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖的作用,與單獨(dú)使用抗CD3/CD28抗體的雙抗對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)(P<0.01)

8、。隨著galectin-7濃度增加,T淋巴細(xì)胞增殖加強(qiáng),呈劑量依賴性(P<0.05)。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步研究galectin-7對(duì)T淋巴細(xì)胞分化的影響。Galectin-7蛋白在抗CD3/CD28抗體存在條件下與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)5天后的Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)和Th2細(xì)胞因子(IL-4)表達(dá)和分泌,與單獨(dú)使用抗CD3/CD28抗體的雙抗對(duì)照組相比,galectin-7顯著增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞表達(dá)和分泌INF-γ(P<0.05),對(duì)IL

9、-4的產(chǎn)生無(wú)明顯影響(P>0.05)。IFN-γ是Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的重要標(biāo)志,該結(jié)果提示,在抗CD3/CD28抗體存在條件下,galectin-7誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞的平衡向Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答偏移。
　　結(jié)論:這些結(jié)果提示galectin-7具有新的功能:促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞增殖和向Th1細(xì)胞應(yīng)答偏移。Galectin-7蛋白具有抗感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)自身免疫性疾病和排斥反應(yīng)的作用。通過(guò)抑制galectin-7蛋白的表達(dá)

10、有可能誘導(dǎo)移植免疫耐受和治療自身免疫性疾病。所以,galectin-7在感染、腫瘤、自身免疫性疾病及器官移植后排斥反應(yīng)等免疫相關(guān)性疾病的認(rèn)知和治療方面可能具有重要意義。
　　第三部分Galectin-7蛋白對(duì)TGFβ/Smad3通路的抑制作用
　　目的:在功能性抗CD3/CD28抗體存在的情況下,研究galectin-7蛋白對(duì)pSmad3在T淋巴細(xì)胞中分布的影響,探討galectin-7蛋白促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其向

11、Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答偏移的作用是否與抑制TGFβ/Smad3通路有關(guān)。
　　方法:分離BALB/c小鼠淋巴結(jié)并通過(guò)碾磨濾過(guò)將其制備成單細(xì)胞懸液,在抗CD3/CD28抗體存在的情況,根據(jù)是否加入小鼠galectin-7蛋白分為兩組:雙抗對(duì)照組(抗CD3/CD28抗體),G7+雙抗組(galectin-7蛋白+抗CD3/CD28抗體)。功能性抗小鼠CD3/CD28抗體與T淋巴細(xì)胞共同孵育24h后,G7+雙抗組加入重組小鼠galectin

12、-7蛋白孵育60min。分別應(yīng)用Westernblot和免疫熒光染色的方法分析兩組T淋巴細(xì)胞中g(shù)alectin-7及pSmad3的表達(dá)和定位的情況。
　　結(jié)果:免疫熒光染色結(jié)果顯示,雙抗對(duì)照組T淋巴細(xì)胞galectin-7和pSmad3蛋白均勻分布于胞核和胞漿,而G7+雙抗組T淋巴細(xì)胞galectin-7和pSmad3蛋白主要分布于胞漿,聚集于胞核周圍。Westernblot結(jié)果顯示,galectin-7和pSmad3蛋白在G7+

13、雙抗組T淋巴細(xì)胞胞核的表達(dá)量顯著低于雙抗對(duì)照組(P<0.05)。與此同時(shí),galectin-7和pSmad3蛋白在G7+雙抗組T淋巴細(xì)胞胞漿的表達(dá)量顯著高于雙抗對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:本研究表明,galectin-7可以與抗CD3/CD28抗體活化的T細(xì)胞中的pSmad3蛋白相互作用,并誘導(dǎo)pSmad3蛋白向胞漿轉(zhuǎn)位。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)意味著galectin-7有阻斷活化的T淋巴細(xì)胞TGFβ/Smad信號(hào)通路的作用。本研究首次闡