紫丁香苷純化、鑒定及對ConA刺激的小鼠淋巴細胞增殖和Th1細胞因子的影響.pdf

1、目的:利用大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠層析聯(lián)合制備型高效液相色譜(PHPLC）分離、純化刺五加（AS）中的紫丁香苷，初步探討紫丁香苷對刀豆蛋白A（ConA）刺激的小鼠脾淋巴細胞增殖和Th1細胞因子表達水平的影響。
　　方法:（1）刺五加藥材粉碎后，用70％乙醇浸提，利用HPD100大孔吸附樹脂分離刺五加70%乙醇浸提物，得到10%乙醇組份，10%乙醇組份經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離，得到A-1和A-2組份，通過對PHPLC條件的優(yōu)化，A-1組份

2、以甲醇-水為流動相體系進行分離，得到化合物1，超高效液相色譜法（UPLC）檢測其純度。電噴霧離子源高分辨串級飛行時間質(zhì)譜（ESI-QTOF-MS）、核磁共振氫譜（1HNMR）、核磁共振碳譜（13CNMR）鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。（2）MTT法檢測紫丁香苷2-256μg/mL濃度范圍內(nèi)對正常小鼠脾淋巴細胞存活率的影響，并根據(jù)參考文獻確定紫丁香苷低、中、高三個劑量組。（3）實驗分為空白對照組，ConA組，ConA刺激下紫丁香苷低、中、高三個劑量組。

3、MTT法檢測紫丁香苷對ConA刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。ELISA法檢測紫丁香苷對ConA刺激小鼠脾淋巴細胞分泌的TNF-α、IFN-γ、IL-2表達的影響。RT-qPCR法檢測紫丁香苷對ConA刺激小鼠脾淋巴細胞分泌的TNF-α mRNA、IFN-γmRNA、IL-2 mRNA表達的影響。
　　結(jié)果:（1）刺五加經(jīng)大孔吸附樹脂和葡聚糖凝膠層析粗分得到A-1組份， A-1組份以甲醇-水為流動相體系經(jīng)過PHPLC分離得到化合物1

4、，經(jīng)UPLC檢測化合物1的純度為98.9%，經(jīng)ESI-QTOF-MS、1HNMR和13CNMR鑒定，該化合物為紫丁香苷。（2）紫丁香苷在2-256μg/mL濃度范圍內(nèi)，小鼠脾淋巴細胞的存活率均在88%以上。確定紫丁香苷高、中、低劑量分別為256、128、64μg/mL。（3）MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ConA組顯著促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，增殖率為91.77%，有顯著性差異(P<0.05)；與ConA組比較，不同劑量紫丁香苷組顯

5、著抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞增殖，增殖率分別為21.58%、26.09%、33.85%，有顯著性差異(P<0.05)。（4） ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組 TNF-α（17.768±3.389 pg/mL）、IFN-γ（18.897±8.144 pg/mL）、IL-2（21.813±11.923 pg/mL）比較， ConA組 TNF-α（105.079±8.035 pg/mL）、IFN-γ（107.960±9.032 pg/

6、mL）、IL-2（84.017±9.903 pg/mL）表達升高，有顯著性差異(P<0.05)；與ConA組比較，紫丁香苷不同劑量組顯著降低ConA刺激小鼠脾淋巴細胞分泌的TNF-α（76.964±9.121 pg/mL、32.539±7.044 pg/mL、27.96±8.513 pg/mL）、IFN-γ（72.823±10.317 pg/mL、46.951±11.504 pg/mL、40.123±12.884 pg/mL）、IL-2

7、（41.113±9.981 pg/mL、31.795±8.762 pg/mL、26.478±10.589 pg/mL）的表達，有顯著性差異(P<0.05)。（5）RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組TNF-αmRNA（1.003±0.031）、IFN-γmRNA（1.003±0.089）、IL-2 mRNA（1.002±0.075）比較，ConA組TNF-α（2.547±0.184）、IFN-γ（2.378±0.218）、IL-2（3.

8、089±0.137）的表達升高；與ConA組比較，紫丁香苷不同劑量組顯著降低ConA刺激小鼠脾淋巴細胞分泌的TNF-αmRNA（2.281±0.191、1.781±0.122、1.391±0.075）、IFN-γmRNA（1.995±0.021、1.647±0.124、1.239±0.072）、IL-2 mRNA（1.819±0.085、1.648±0.090、1.182±0.038）的表達，有顯著性差異(P<0.05)。
　　結(jié)