人骨膜細(xì)胞與PLA支架復(fù)合物的生物活性和超微結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、目的：
　　探究人骨膜來源成骨細(xì)胞與PLA（聚乳酸）三維生物支架在體外構(gòu)建骨組織工程骨的生物活性及超微結(jié)構(gòu)特征。
　　方法：
　　以小腿截肢患者脛骨骨膜組織為原材料，采用組織塊法分離培養(yǎng)骨膜細(xì)胞，置于含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)至第三代的骨膜細(xì)胞改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)后傳代至第二代的鋪滿細(xì)胞瓶約80%的骨膜來源成骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞。（1）將種子細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）及

2、第三代骨膜細(xì)胞（對照組）以1×104/ml密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)5、10、15天后進(jìn)行堿性磷酸酶(改良Kaplow氏法)及鈣結(jié)節(jié)(茜素紅染色法)染色，隨機(jī)選取3個視野統(tǒng)計視野中染色陽性率并做統(tǒng)計分析。（2）將種子細(xì)胞以1×106/ml的密度接種到 PLA三維生物支架（實(shí)驗(yàn)組）及普通24孔二維細(xì)胞培養(yǎng)板（對照組）進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，在培養(yǎng)的1、3、5、7、9、11天采用CCK-8法檢測倆組的細(xì)胞數(shù)目并繪制細(xì)胞增殖曲線。（3）將種子細(xì)胞

3、與PLA三維生物支架體外復(fù)合培養(yǎng)3、6、9、12天后的細(xì)胞支架復(fù)合物制成切片，在掃描電鏡及透射電鏡下觀察。
　　結(jié)果：
　　1、骨膜來源成骨細(xì)胞組（實(shí)驗(yàn)組）和骨膜細(xì)胞組（對照組）ALP染色和鈣結(jié)節(jié)染色陽性率隨培養(yǎng)時間增加均逐漸增高；實(shí)驗(yàn)組較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、CCK-8法檢測倆組細(xì)胞生長曲線均呈“S”型。倆組潛伏期相似，均在第3天進(jìn)入對數(shù)生長期；實(shí)驗(yàn)組在對數(shù)生長期增殖速度稍快，細(xì)

4、胞數(shù)目在第7天達(dá)到高峰，之后出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，對照組第7天后進(jìn)入平穩(wěn)期，未出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目減少現(xiàn)象。
　　3、掃描電鏡下3天時細(xì)胞粘附在PLA支架璧上，伸展良好，形狀多為梭形，略光滑，細(xì)胞突起較少；6天時細(xì)胞細(xì)胞呈三維立體樣伸展，形狀多樣，較多突起粘附于支架，大量絲狀偽足交織成網(wǎng)狀；9天時細(xì)胞聚集，絲狀偽足周圍基質(zhì)分泌；12天時細(xì)胞胞體變小，可見殘余的偽足。
　　4、透射電鏡下3天見細(xì)胞的突起粘附在PLA三維支架，細(xì)胞器較少

5、，細(xì)胞核較規(guī)則，胞質(zhì)疏松，溶酶體較多；6天時見細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核不規(guī)則，呈分葉狀，見分裂的核仁，細(xì)胞器豐富，高爾基體末端膨大成池。9天細(xì)胞聚集區(qū)外可見到少量老化、凋亡的細(xì)胞，線粒體腫脹，嵴消失，細(xì)胞核溶解，聚集區(qū)細(xì)胞未見異常；12天見到較多凋亡、崩解的細(xì)胞，線粒體腫脹變性，細(xì)胞器溶解，出現(xiàn)膜空泡結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　1、人骨膜細(xì)胞在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)可分化為具有良好成骨能力的成骨細(xì)胞，人骨膜來源成骨細(xì)胞在PLA三維生物支

6、架內(nèi)具有良好的細(xì)胞增殖能力。
　　2、PLA三維生物支架具有良好的生物相容性，人骨膜來源成骨細(xì)胞在支架伸展、粘附良好，呈三維立體樣生長；在復(fù)合培養(yǎng)早期生長狀態(tài)良好，增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞器豐富、功能活躍。
　　3、細(xì)胞支架復(fù)合物在體外復(fù)合培養(yǎng)1周后需及時植入體內(nèi)在較完善的細(xì)胞生長環(huán)境下進(jìn)一步構(gòu)骨，體外培養(yǎng)過程缺乏一些必要的生物因子容易出現(xiàn)細(xì)胞功能的老化。
　　4、構(gòu)建的組織工程骨體外培養(yǎng)時容易出現(xiàn)支架內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物交