TGF-β1 shRNA對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞基質(zhì)合成和超微結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、腹膜纖維化是腹膜透析主要的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致腹膜透析技術(shù)性失敗的主要原因。腹膜纖維化的發(fā)生可使腹膜透析患者腹膜超濾效能下降和腹透中斷，嚴(yán)重時(shí)還可危及生命。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，腹膜細(xì)胞的損傷和伴隨的腹膜內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的積聚被認(rèn)為是導(dǎo)致腹膜纖維化的關(guān)鍵因素，其中非生理性的腹透液及其產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子等共同促進(jìn)這一過(guò)程。 大量的研究表明，TGF-β1的過(guò)度表達(dá)在腹膜纖維化纖維化機(jī)制中起

2、關(guān)鍵作用，因此也被視為治療腹膜纖維化最主要的靶目標(biāo)。有研究證明抑制TGF-β1的過(guò)度表達(dá)或阻止其效應(yīng)確實(shí)可減輕腹膜纖維化病變，包括使用一些藥物、抗體或反義核酸技術(shù)，但目前仍未找到一種較為理想的方法抑制腹膜細(xì)胞中TGF-β1的過(guò)度表達(dá)。 近年來(lái)RNA干擾(RNAi)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為我們提供了新的思路。RNA干擾是真核生物進(jìn)化上的保守機(jī)制，在大多數(shù)真核生物包括人類都存在。RNA干擾表現(xiàn)為雙鏈RNA觸發(fā)導(dǎo)致序列特異性的mRNA降解。RNA

3、干擾能通過(guò)導(dǎo)入與目標(biāo)基因具有同源序列的短雙鏈RNA(小干擾RNAs，siRNAs)或短發(fā)夾狀RNA(shRNA)介導(dǎo)序列特異性基因表達(dá)抑制。僅僅幾年前，生物學(xué)家還只能在植物或者線蟲(chóng)中使用RNAi技術(shù)去獲取對(duì)于基因功能的更多了解，但是近幾年得到突破性進(jìn)展，RNAi已在基因治療方得到了廣泛應(yīng)用。由于RNAi技術(shù)本身的特性，從理論上來(lái)說(shuō)可以可用來(lái)特異性抑制幾乎所有的基因，而TGF-β1在腹膜纖維化中的關(guān)鍵作用已被證實(shí)，因此，利用RNAi技術(shù)抑

4、制TGF-β1在腹膜細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)成為一種合理的選擇。 在前期研究中我們已經(jīng)構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)TGF-β1shRNA的質(zhì)粒(pcDU6-A1-B1和pcDU6-A2-B2)，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中初步證明了其抑制效應(yīng)。本文中使用這兩種載體轉(zhuǎn)染人腹膜間皮細(xì)胞，研究其對(duì)于腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)TGF-β1的表達(dá)和細(xì)胞基質(zhì)合成的影響，以及HPMCs超微結(jié)構(gòu)的變化。 目的：利用我們構(gòu)建的TGF-β1shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HPMCs，了解

5、其對(duì)于HPMCs在腹透液和高糖誘導(dǎo)下TGF-β1表達(dá)的抑制作用，以及對(duì)于HPMCs基質(zhì)合成的影響和超微結(jié)構(gòu)的變化。 方法：體外培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV5)，使用不同濃度腹透液刺激，觀察shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)于其TGF-β1表達(dá)的影響及超微結(jié)構(gòu)的變化。HPMCs中TGF-β1mRNA的表達(dá)采用半定量RT-PCR檢測(cè)，培養(yǎng)液中TGF-β1蛋白質(zhì)水平采用雙抗夾心法ELISA檢測(cè)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。此外，體外培養(yǎng)原代HP

6、MCs，使用高糖刺激，觀察shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)于其TGF-β1表達(dá)及FN、CollagenⅠ合成的影響，mRNA的表達(dá)采用半定量RT-PCR，培養(yǎng)液中TGF-β1和FN蛋白質(zhì)水平采用雙抗夾心法ELISA檢測(cè)，細(xì)胞內(nèi)FN和CollagenⅠ的蛋白質(zhì)水平采用Westernblot檢測(cè)。 結(jié)果：4.25％腹透液可使腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV5)TGF-β1表達(dá)明顯增高(p＜0.01)，而shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TGF-β1表達(dá)

7、明顯被抑制(p＜0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組與4.25％腹透液刺激組則無(wú)明顯差異(p＞0.05)；透射電鏡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比在微絨毛減少和線粒體水腫程度上稍有減輕。高糖(50mmol/L)可使HPMCsTGF-β1表達(dá)明顯增高(p＜0.01)，F(xiàn)N和CollagenⅠ表達(dá)也增高(p＜0.01)，而shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TGF-β1表達(dá)明顯被抑制(p＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)外的FN和細(xì)胞內(nèi)的CollagenⅠ

8、蛋白表達(dá)也被明顯抑制(p＜0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組與高糖刺激組相比無(wú)顯著差別(p＞0.05)。結(jié)論：4.25％腹透液可刺激HPMCsTGF-β1表達(dá)明顯增高； TGF-β1shRNA表達(dá)載體對(duì)于4.25％腹透液導(dǎo)致的HPMCs細(xì)胞株超微結(jié)構(gòu)的改變可能具有一定的保護(hù)作用。高糖可刺激HPMCsTGF-β1、FN和CollagenⅠ表達(dá)明顯增高；TGF-β1shRNA表達(dá)載體可抑制腹透液和高糖誘導(dǎo)的HPMCsTGF-β1的高表達(dá)，并抑