TRAIL、AD5-10與表阿霉素聯(lián)合作用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以致殘性多關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的常見的慢性自身免疫性疾病,關(guān)節(jié)滑膜表面的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)在RA的長期病程中起關(guān)鍵作用,可以早期參與并觸發(fā)自身免疫應(yīng)答,通過分泌趨化因子、促炎因子、促進(jìn)NO合成等參與炎癥反應(yīng),可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成來破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu),并且FLS可以維持自身過度增殖,生長特性類似于局限性侵襲性生長的腫瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)RA滑膜

2、細(xì)胞凋亡可為發(fā)展新的RA治療藥物提供一種新途徑。
　　 TRAIL(Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)發(fā)現(xiàn)于1995年,是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員。TRAIL能夠誘導(dǎo)多數(shù)腫瘤細(xì)胞凋亡,而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞無毒性,因而被廣泛用于癌癥治療研究。此外,我們實(shí)驗(yàn)室前期研究中獲得了小鼠抗人DR5(死亡受體5)的單克隆抗體AD

3、5-10,在無交聯(lián)劑的情況下,能引起多種腫瘤細(xì)胞凋亡。提示我們TRAIL和AD5-10有可能通過誘導(dǎo)FLS凋亡成為潛在的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療藥物。
　　 本論文研究了TRAIL和AD5-10聯(lián)合表阿霉素對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)炎的治療作用及其機(jī)制。從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后關(guān)節(jié)切除物分離FLS細(xì)胞,用不同濃度TRAIL,或AD5-10和不同濃度表阿霉素(Epirubicin,EPB)聯(lián)合處理FLS,MTT法測定細(xì)胞存活率,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用TR

4、AIL或AD5-10時(shí),細(xì)胞存活率無變化；而在同時(shí)加入不同濃度化療藥物表阿霉素EPB時(shí),FLS細(xì)胞死亡的能力大大加強(qiáng),且呈濃度依賴性。說明表阿霉素和TRAIL或AD5-10聯(lián)用對(duì)FLS的殺傷具協(xié)同作用。
　　 我們進(jìn)一步研究了細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)通路分子的變化。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)單獨(dú)使用TRAIL或AD5-10時(shí),caspase級(jí)聯(lián)通路分子沒有發(fā)生明顯的變化,而當(dāng)與表阿霉素連用時(shí),pro-caspase-3、8、9都發(fā)生了明顯的剪切,提示聯(lián)用

5、使FLS發(fā)生了凋亡。此外,表阿霉素處理可使FLS細(xì)胞表面死亡受體DR4、DR5的表達(dá)上調(diào),凋亡抑制蛋白c-FLIP、Bcl-2水平下降,細(xì)胞周期蛋白P21水平下調(diào),P53表達(dá)水平上調(diào),提示這可能是表阿霉素協(xié)同TRAIL或AD5-10誘導(dǎo)FLS凋亡的分子機(jī)制。
　　 在這些工作的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步探討了將AAV-TRAIL應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的可行性。通過體外研究發(fā)現(xiàn)rAAV2/5比rAAV2/2侵染FLS的效率更高,而表阿霉素

6、可顯著增強(qiáng)rAAV2/5在FLS中介導(dǎo)的外源基因表達(dá)。在rAAV2/5-eGFP侵染后的FLS中加入50ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml EPB可使熒光強(qiáng)度分別從11.0％提高到26.8％、84.9％、90.5％。而用rAAV2/5-TRAIL侵染FLS4h后,加入濃度為50 ng/ml、200 ng/ml的EPB時(shí),培養(yǎng)上清中TRAIL,含量從57.59±3.67μg/ml上升到228.77±34.80μg/ml、51