外源性糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠垂體前葉細(xì)胞凋亡和中藥干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、背景和目的
　　 糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)是腎上腺皮質(zhì)激素的一種,由束狀帶合成和分泌,具有重要的生理學(xué)意義。目前,GC已經(jīng)成為臨床各科室廣泛應(yīng)用的藥物,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗休克、免疫抑制等藥理作用。但長(zhǎng)期大量系統(tǒng)應(yīng)用GC會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),諸如感染(病毒、細(xì)菌、真菌等)、消化道潰瘍或穿孔、皮質(zhì)功能亢進(jìn)或減退、電解質(zhì)紊亂、骨質(zhì)疏松或缺血性骨壞死、以及對(duì)神經(jīng)精神的影響等,還可加重原有的糖尿病、高血壓等,

2、不適當(dāng)?shù)耐Ｋ幓驕p量還可引起病情反跳。近年來(lái),在深入研究GC作用機(jī)理的同時(shí)對(duì)減輕其副作用的措施也進(jìn)行了一系列卓有成效的研究。目前的共識(shí):GC的釋放受到下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis,HPAA)的調(diào)控,它又對(duì)此神經(jīng)內(nèi)分泌環(huán)施行強(qiáng)烈的負(fù)反饋?zhàn)饔?。GC負(fù)反饋?zhàn)饔没疚稽c(diǎn)除了下丘腦和海馬結(jié)構(gòu)外,主要就是垂體前葉的促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic Hormon

3、e,ACTH)細(xì)胞。用下丘腦室旁核分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin Release Hormone,CRh)刺激這些細(xì)胞導(dǎo)致ACTH的釋放,ACTH是腎上腺皮質(zhì)合成和釋放GC的主要刺激物。GC對(duì)于ACTH細(xì)胞功能的負(fù)反饋?zhàn)饔冒l(fā)生在幾個(gè)水平上,最具特征性的是對(duì)ACTH的合成和釋放以及CRH受體的表達(dá)。任何劑量的GC如果抑制了CRH和ACTH的分泌,且在用藥期內(nèi)這種抑制沒(méi)有被恢復(fù),均會(huì)產(chǎn)生中心性腎上腺分泌不足,久而

4、久之會(huì)引起外周腎上腺的萎縮。GC長(zhǎng)期治療后的停藥,無(wú)論在人還是鼠上均出現(xiàn)了HPAA對(duì)內(nèi)源性或者外源性刺激的反應(yīng)功能降低,這種功能變化反映在HPAA的各層次器官上。有人將鼠腎上腺切除后2周,給予持續(xù)的地塞米松導(dǎo)致了鼠垂體前葉細(xì)胞非常顯著的凋亡活動(dòng),同時(shí)有絲分裂活動(dòng)被抑制。盡管不可能知道是垂體的哪一類細(xì)胞減少,但已經(jīng)提示總的垂體細(xì)胞減少到2周前基礎(chǔ)水平以下。LA Nolan等人認(rèn)為,GC停藥伴隨著短時(shí)或長(zhǎng)時(shí)的HPAA的分泌能力的損傷。這種垂

5、體前葉對(duì)GC的反應(yīng)在鼠上包括了凋亡介導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量減少、被損傷細(xì)胞的恢復(fù)、未定型的前體細(xì)胞分化及其他類型分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。這預(yù)示著,如果有足夠的時(shí)間垂體前葉細(xì)胞完全恢復(fù)是可能的。
　　 中醫(yī)認(rèn)為,“腎”的功能涉及到垂體.腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng),HPAA是中西醫(yī)結(jié)合腎本質(zhì)研究的一個(gè)焦點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)腎虛本質(zhì)和補(bǔ)腎藥作用機(jī)理的探討取得了多方面的進(jìn)展。廣泛涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和基礎(chǔ)代謝等方面。臨床上用補(bǔ)腎方藥治療腎虛病人長(zhǎng)能調(diào)節(jié)陰陽(yáng)、改善癥

6、狀恢復(fù)健康。補(bǔ)腎中藥與GC合用,可減輕或消除長(zhǎng)期應(yīng)用GC所致的腦垂體前葉細(xì)胞的形態(tài)改變。中醫(yī)辨證論治的目的在于腎陰陽(yáng)平衡上著手調(diào)整,使HPAA功能得以恢復(fù)。張景岳創(chuàng)制的右歸丸常被作為“陰中求陽(yáng)”的代表方,它選用大量補(bǔ)陰藥填補(bǔ)命門真陰,以治命門火衰,用少量補(bǔ)陽(yáng)藥溫陽(yáng)化氣、直接溫補(bǔ)腎陽(yáng)。羅漢文等報(bào)道,右歸丸可以提高血中可的松濃度,使垂體ACTH細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組。
　　 基于上述的理論依據(jù),本實(shí)驗(yàn)選用右歸丸作為GC導(dǎo)致HPAA功能抑制

7、的保護(hù)性藥物,探討其作用機(jī)理可能與減輕GC誘導(dǎo)的垂體前葉細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 二、方法
　　 通過(guò)外源性給予糖皮質(zhì)激素建立大鼠腎陽(yáng)虛模型,即糖皮質(zhì)激素副作用動(dòng)物模型,進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；利用原代培養(yǎng)的垂體前葉細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)；按照隨機(jī)對(duì)照的原則分組；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、TUNEL染色、Real-Time qPCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組垂體前葉細(xì)胞的凋亡量、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及線粒體膜電位的變化；方差分析比較各組的差異,得出

8、結(jié)論。
　　 三、結(jié)果
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均得出地塞米松加右歸丸組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于地塞米松組(P<0.05)；凋亡促進(jìn)蛋白及其mRNA的表達(dá)在地塞米松加右歸丸組明顯少于地塞米松組(P<0.05),而抗凋亡蛋白及其mRNA在地塞米松組的表達(dá)高于地塞米松組(P<0.05)；線粒體膜電位下降的細(xì)胞數(shù)在地塞米松加右歸丸組明顯少于地塞米松組(P<0.05)。
　　 四、結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠體內(nèi)和體外