慢病毒介導(dǎo)Bcl-2基因在大鼠體內(nèi)的表達(dá)及對(duì)化療后卵巢功能影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF），又稱(chēng)絕經(jīng)綜合征，主要為40歲前卵巢功能停止活動(dòng)。近年來(lái)POF的發(fā)病率逐年增高，臨床上給患者外源性補(bǔ)充性激素可改善部分患者雌激素低下的癥狀，防治骨質(zhì)疏松，提高生活質(zhì)量，但因有一定副作用，長(zhǎng)期服用令患者的接受性及依從性差，且不能解決POF導(dǎo)致的無(wú)排卵性不孕問(wèn)題，因此有必要對(duì)其進(jìn)行深入的研究。 POF系由多種病因所致的卵巢功能過(guò)早衰竭，多發(fā)生于40歲以下婦女。臨

2、床表現(xiàn)為原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)，以血清中促卵泡生成激素（FSH）水平上升>401U/L和雌二醇（E2）水平下降<25 pg/mL為特征，并有不同程度的一系列低雌激素癥狀，如：潮熱、多汗、面部潮紅、性欲低下等。 1984年Tsujimoto等從與濾泡性淋巴細(xì)胞瘤相關(guān)的t（14；18）染色體易位的斷裂點(diǎn)克隆到一種抗凋亡基因，命名為Bcl-2（B-cell lymphoma2）基因。Bcl-2基因編碼一個(gè)25-26KD的蛋白，其C端的21

3、個(gè)疏水氨基酸組成一個(gè)延伸的鏈狀結(jié)構(gòu)。這個(gè)鏈可以插到細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)中，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方式和能力非常有關(guān)。已經(jīng)證實(shí)Bcl-2存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。根據(jù)對(duì)Bcl-2家族成員蛋白的結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)其共同點(diǎn)是在蛋白鏈上都存在三個(gè)結(jié)構(gòu)基序，分別稱(chēng)為BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域。 慢病毒（Ientivirus）載體是以HIV-Ⅰ（人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。它能相對(duì)定點(diǎn)整合到染色體的特

4、定位置，在分裂和非分裂細(xì)胞中都能高效表達(dá)。研究表明，以HIV-Ⅰ為基礎(chǔ)構(gòu)建的這類(lèi)慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，適于體內(nèi)基因治療。在用HIV-Ⅰ載體已經(jīng)進(jìn)行的所有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，未出現(xiàn)過(guò)有復(fù)制力的HIV，說(shuō)明其安全性是有保證的。 綠色熒光蛋白（Green Fluorscent Protein，GFP）是從水母中分離獲得的一種發(fā)光蛋白，最早由Shimomura和Johnson等從

5、水螅、水母類(lèi)動(dòng)物Aequorea Victoria中分離、純化。這種蛋白由GFP基因編碼，在藍(lán)色激發(fā)光下可產(chǎn)生綠色或黃綠色熒光，經(jīng)熒光顯微鏡、熒光激活細(xì)胞分揀器即可檢測(cè)到。GFP檢測(cè)時(shí)不需要添加任何底物或輔助因子，檢測(cè)方便，檢測(cè)靈敏度高；熒光穩(wěn)定，熒光保持時(shí)間長(zhǎng)；不干擾正常卵巢的結(jié)構(gòu)和功能。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorscent Protein，EGFP）是GFP的一個(gè)突變體；64位點(diǎn)的Phe→Leu，6

6、5位點(diǎn)的Ser→Thr，發(fā)射出的熒光強(qiáng)度比GFP大6倍以上。因此，比GFP更適合作為一種報(bào)告基因來(lái)研究基因表達(dá)、調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生物體定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等。 近年來(lái)有研究者在卵巢組織檢測(cè)到B細(xì)胞淋巴瘤（Bcl）-2基因，能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌Bcl-2蛋白，以自分泌/旁分泌的方式調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞的增殖分化，是卵泡持續(xù)發(fā)育所必須的調(diào)控蛋白。因此，本課題擬通過(guò)研究慢病毒介導(dǎo)Bcl-2基因在大鼠體內(nèi)的表達(dá)及對(duì)化療后卵巢功能的影響，以

7、確定對(duì)化療后卵巢功能是否有一定的改善作用。 研究目的: 本研究通過(guò)探索慢病毒介導(dǎo)Bcl-2基因在大鼠體內(nèi)的表達(dá)和通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）建立化療性卵巢衰竭動(dòng)物模型，將Bcl-2基因通過(guò)攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的慢病毒載體介導(dǎo)，注射至雙側(cè)卵巢部位，檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，觀察卵巢結(jié)構(gòu)及功能變化情況，探索慢病毒介導(dǎo)Bcl-2基因治療化療所致卵巢損傷的可行性及療效，為臨床上延緩女

8、性生理機(jī)能衰老、治療因化療引起的不育或過(guò)早停經(jīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 材料和方法: 1.選用SPF級(jí)2～3月齡、200±20g雌性Wistar大鼠，每日清晨9：00行陰道涂片，顯微鏡下觀察動(dòng)情周期，選擇有正常動(dòng)情周期的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。 2.預(yù)實(shí)驗(yàn)：摸索空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染正常大鼠卵巢組織的最低有效劑量：12只大鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，均以水合氯醛按3ml/Kg腹腔注射麻醉后，自腹中線打開(kāi)腹腔，暴露雙側(cè)卵巢。三組大鼠均在雙側(cè)

9、卵巢實(shí)質(zhì)分別注入攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的空載-HIV-Ⅰ，但劑量不同。第一組（低劑量組）：1μl；第二組（中劑量組）：5μl；第三組（高劑量組）：10μl。分別于注射后每日觀察大鼠進(jìn)食、大小便、活動(dòng)、體毛、體重和動(dòng)情周期情況；注射后第7、14、21、28天處死大鼠（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)低劑量組n=1，中劑量組n=1，高劑量組n=1），處死后取出雙側(cè)卵巢分別稱(chēng)重，然后行冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察各組EGFP的表達(dá)，同時(shí)行HE染色觀察卵巢

10、組織結(jié)構(gòu)的變化情況。 3.慢病毒介導(dǎo)Bcl-2基因?qū)熀蟠笫舐殉补δ苡绊懙膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)：將60只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：①空白對(duì)照組15只：不予任何藥物處理；②實(shí)驗(yàn)對(duì)照組15只；③空載對(duì)照組15只；④實(shí)驗(yàn)組15只。②③④組均采用同一方法及相同劑量建立化療性卵巢衰竭模型，具體方法如下：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每組均給予首次負(fù)荷劑量CTX50 mg/（kg·d），腹腔內(nèi)注射，1 d；CTX8 mg/（kg·d），腹腔內(nèi)注射，連續(xù)14 d

11、。停藥第1天，這三組均開(kāi)腹行雙卵巢局部注射，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組注射生理鹽水5μl；空載對(duì)照組注射空載HIV-Ⅰ5μl；實(shí)驗(yàn)組注射Bcl-2-HIV-Ⅰ5μl。從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到結(jié)束，四組大鼠每天行陰道涂片。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、停藥當(dāng)天、停藥第15天和第30天取血測(cè)定各組FSH、E2濃度；停藥第15天處死各組7只大鼠，停藥第30天處死各組剩余大鼠，分別留取子宮和卵巢，所有標(biāo)本均分別行石蠟包埋及冰凍切片，蘇木素.伊紅（Hematoxylin-Yihong，HE

12、）染色。比較卵巢重量及卵泡數(shù)量變化，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)情況。采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況及蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot法）檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)情況。 結(jié)論: 1.本研究發(fā)現(xiàn)慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染大鼠卵巢組織，對(duì)大鼠的體重?zé)o明顯影響，且對(duì)卵巢組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，鄰近器官子宮無(wú)熒光表達(dá)，慢病毒只局限在注射的局部。提示本

13、研究使用的慢病毒載體具有安全性，為今后的臨床實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 2.慢病毒介導(dǎo)Bcl-2基因成功轉(zhuǎn)染大鼠卵巢組織后，可以抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，可能是由于促進(jìn)了Bcl-2抗凋亡蛋白分泌所致。 3.慢病毒介導(dǎo)的Bcl-2基因可以部分改善化療后大鼠卵巢功能，可能的機(jī)制為上調(diào)了Bcl-2基因表達(dá)水平，抑制了顆粒細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)了卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素。 4.由于實(shí)驗(yàn)條件有限，未能在停藥后進(jìn)行交配，故大鼠的生育功能