環(huán)磷酰胺對大鼠卵巢功能損害的實驗研究.pdf

1、醫(yī)源性卵巢功能損害已經成為目前臨床上一個亟需解決的難題。近二十幾年來，由于新的化療藥物應用和采用新的更合理、有效的化療方案，腫瘤患者生存率明顯提高，尤其對于某些腫瘤如惡性淋巴瘤、乳腺癌等患者，可明顯延長生存期，甚至可達到治愈。據(jù)統(tǒng)計在2000年，每1000個成人中就有1人曾在青少年時期進行過抗癌治療。據(jù)報道，64％的成年女性病人經歷腫瘤治療后伴隨有一項或多項卵巢功能衰竭的癥狀，其中化療所致的卵巢功能損害雖不影響原發(fā)病的無病生存期，但可嚴

2、重影響患者的生活質量，而且直接促進某些嚴重疾病的發(fā)生，如卵巢早衰導致年輕婦女不育、提前閉經引起的一系列內分泌變化等，可增加心血管疾病的發(fā)生率，也可導致骨質疏松。因此，研究和防治化療相關性卵巢功能損傷具有重要意義。 據(jù)國內外報道，環(huán)磷酰胺(CTX)是影響卵巢功能最大的化療藥物之一?；熞鸬穆殉苍缢ヅc病人年齡和化療藥物的種類、累積劑量、藥物濃度及用藥持續(xù)時間密切相關。臨床上無法以獲取人類卵巢組織的方式進行卵巢儲備功能的相關研究，此

3、外，化療時多為聯(lián)合用藥，因而較難評估單個化療藥物對卵巢功能的影響。本研究擬用CTX單一藥物作用于大鼠，通過觀察比較用藥前后大鼠卵巢的各級卵泡數(shù)目、血促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E<,2>)、卵巢重量、大鼠陰道涂片了解動情周期變化這幾個指標來評價卵巢儲備功能，同時觀察用藥后不同時限的大鼠卵巢儲備功能改變情況，比較不同月齡組的大鼠用藥后卵巢功能的改變，從而為指導臨床選擇實施卵巢功能保護的對象提供重要信息。 研究目的 1．

4、建立CTX對卵巢功能損害的大鼠模型。 2．觀察檢測CTX作用下卵巢功能變化的相關指標。 3．觀察CTX用藥后大鼠卵巢儲備功能變化的相關因素。 4．觀察CTX對不同月齡大鼠卵巢功能的影響。 研究內容與方法 1．研究對象： 60只清潔級成年Spragne-Dawley(SD)雌性大鼠，鼠齡60～70天，體重230±10g；36只清潔級未成年(SD)雌性大鼠，鼠齡3周，體重50±5g，均購自中山

5、大學動物實驗中心，合格證號：SCXK(粵)2004-0011。給予標準光照(14小時光照、10小時黑夜)，全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，室溫20-25℃，相對濕度45～55％。 2．研究方法： 2．1 大鼠卵巢功能損害模型的建立 60只60～70天的清潔級成年雌性SD大鼠分為空白對照組(生理鹽水組)和環(huán)磷酰胺(CTX組)分別于用藥后3天、1周、2周、4周、8周觀察動情周期、稱取卵巢重量、進行卵巢組織形態(tài)學觀察及卵泡

6、計數(shù)、測定血清E<,2>、FSH，評估卵巢儲備功能，從而建立大鼠卵巢功能損害模型。 2．2 分組與用藥 2．2．1 將進入實驗的60只60～70天的清潔級成年雌性SD大鼠隨機分成2組：空白對照組和CTX組，即Ⅰ組和Ⅱ組。每組30只。 Ⅰ組(空白對照組)：用0.9％生理鹽水腹腔注射1ml一次，以上動物均在用藥后每日定時取陰道分泌物涂片觀察動情周期，分別于用藥后3天、1周、2周、4周、8周于動情期處死動物，分為Ⅰ A

7、組、Ⅰ B組、Ⅰ C組、Ⅰ D組、Ⅰ E組，每組均為6只。取血清置入-80℃冰箱待測。取左側卵巢稱取濕重后，左側卵巢送病理檢查。Ⅱ組(CTX組)：CTX 75mg/kg腹腔注射一次。處理同上，分為ⅡA組、ⅡB組、Ⅱ C組、Ⅱ D組、Ⅱ E組，每組均為6只。 2．2．2 將進入實驗的36只3周齡清潔級未成年雌性SD大鼠隨機分成2組：空白對照組(生理鹽水組)和環(huán)磷酰胺(CTX)組，即Ⅲ組和Ⅳ組，每組18只。 Ⅲ組(空白對照組

8、)：用0.9％生理鹽水腹腔注射0.6ml一次，分別于用藥后3天、1周、2周處死動物，分為ⅢA組、ⅢB組、ⅢC組，每組為6只。取血清置入-80℃冰箱待測。取左側卵巢稱取濕重后，左側卵巢送病理檢查。 Ⅳ組(CTX組)：CTX 100mg/kg腹腔注射一次。處理同上，分為ⅣA組、ⅣB組、ⅣC組，每組均為6只。 2．3 實驗檢測指標 2．3．1 大鼠動情周期的觀察：取陰道分泌物涂片蘇木素伊紅染色后鏡檢。 2．3．

9、2 卵巢重量的影響：取左側卵巢，以電子稱稱重。 2．3．3 卵巢組織形態(tài)學觀察及卵泡計數(shù)：病理切片為連續(xù)5μm切片，每間隔9張取一張切片(即第10張)，計算卵泡數(shù)，累積計數(shù)每個卵巢原始卵泡、初級卵泡、生長卵泡和成熟卵泡數(shù)目。 2．3．4 大鼠血清E<,2>、FSH的測定：采用雙抗體夾心ELISA法。 結果 1．本研究成年ⅡA組、ⅡB組、ⅡC組、ⅡD組、ⅡE卵巢原始卵泡數(shù)分別與對照組比較，原始卵泡數(shù)均減少，

10、差異有顯著性(p<0.05)。成年ⅡA組、ⅡB組、Ⅱ C組初級卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)分別與對照組比較，初級卵泡、生長卵泡、成熟卵泡數(shù)增多，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。成年ⅡA組、Ⅱ B組、ⅡC組、ⅡD組血清E<,2>分別與對照組比較，血清E<,2>降低，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。成年ⅡA組、ⅡB組血清FSH分別與對照組比較，血清FSH升高，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。成年CTX組大鼠第1、2周陰道涂片顯示動情周期發(fā)生改變

11、，規(guī)則的動情周期變化消失，周期延長為8～17天，絕大多數(shù)停止于動情間期。成年ⅡB組、ⅡC組、ⅡD組、ⅡE組卵巢重量分別與對照組比較，卵巢重量減輕，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。顯示，CTX 75mg/kg腹腔注射一次，用藥后3天、1周、2周卵巢功能均受到損害，CTX對大鼠卵巢功能損害的模型建模成功。 2．CTX對未成年大鼠卵巢功能的影響：未成年ⅣC組大鼠卵巢初級卵泡數(shù)減少，ⅣB組生長卵泡數(shù)增加，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(p<0.

12、05)。ⅣA組、ⅣB組、ⅣC組原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)與對照組比較，兩者差異無顯著性意義(p>0.05)，ⅣB組血清E<,2>、FSH 與對照組比較，血清E<,2>降低，F(xiàn)SH升高，有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，而未成年ⅣA組、ⅣC組血清E<,2>、FSH與對照組比較，兩者差異無顯著性意義(p>0.05)。ⅣC組大鼠卵巢重量減輕，與對照組比較，兩者差異有顯著性意義(p<0.05)，ⅣA組、ⅣB組大鼠卵巢重量分別與對照組比較，兩者差異無顯著

13、性意義(p>0.05)。 結論 1．本研究采用CTX 75mg/kg單次腹腔注射用藥建立CTX對卵巢功能損害的大鼠模型，成本低，手術操作簡便，建模成功率高，對于研究化療引起卵巢功能損害的機理、卵巢功能保護等是良好的動物實驗模型。 2．本研究結果顯示CTX作用下卵巢形態(tài)學改變最顯著的是原始卵泡數(shù)目減少，提示這可能是其減少卵巢儲備量，致卵巢功能受損的主要機制之一。 3．本研究結果提示卵巢功能損害與大鼠月齡關系