環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠卵巢功能損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、醫(yī)源性卵巢功能損害已經(jīng)成為目前臨床上一個(gè)亟需解決的難題。近二十幾年來(lái)，由于新的化療藥物應(yīng)用和采用新的更合理、有效的化療方案，腫瘤患者生存率明顯提高，尤其對(duì)于某些腫瘤如惡性淋巴瘤、乳腺癌等患者，可明顯延長(zhǎng)生存期，甚至可達(dá)到治愈。據(jù)統(tǒng)計(jì)在2000年，每1000個(gè)成人中就有1人曾在青少年時(shí)期進(jìn)行過(guò)抗癌治療。據(jù)報(bào)道，64％的成年女性病人經(jīng)歷腫瘤治療后伴隨有一項(xiàng)或多項(xiàng)卵巢功能衰竭的癥狀，其中化療所致的卵巢功能損害雖不影響原發(fā)病的無(wú)病生存期，但可嚴(yán)

2、重影響患者的生活質(zhì)量，而且直接促進(jìn)某些嚴(yán)重疾病的發(fā)生，如卵巢早衰導(dǎo)致年輕婦女不育、提前閉經(jīng)引起的一系列內(nèi)分泌變化等，可增加心血管疾病的發(fā)生率，也可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此，研究和防治化療相關(guān)性卵巢功能損傷具有重要意義。 據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，環(huán)磷酰胺(CTX)是影響卵巢功能最大的化療藥物之一。化療引起的卵巢早衰與病人年齡和化療藥物的種類(lèi)、累積劑量、藥物濃度及用藥持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。臨床上無(wú)法以獲取人類(lèi)卵巢組織的方式進(jìn)行卵巢儲(chǔ)備功能的相關(guān)研究，此

3、外，化療時(shí)多為聯(lián)合用藥，因而較難評(píng)估單個(gè)化療藥物對(duì)卵巢功能的影響。本研究擬用CTX單一藥物作用于大鼠，通過(guò)觀察比較用藥前后大鼠卵巢的各級(jí)卵泡數(shù)目、血促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E<,2>)、卵巢重量、大鼠陰道涂片了解動(dòng)情周期變化這幾個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能，同時(shí)觀察用藥后不同時(shí)限的大鼠卵巢儲(chǔ)備功能改變情況，比較不同月齡組的大鼠用藥后卵巢功能的改變，從而為指導(dǎo)臨床選擇實(shí)施卵巢功能保護(hù)的對(duì)象提供重要信息。 研究目的 1．

4、建立CTX對(duì)卵巢功能損害的大鼠模型。 2．觀察檢測(cè)CTX作用下卵巢功能變化的相關(guān)指標(biāo)。 3．觀察CTX用藥后大鼠卵巢儲(chǔ)備功能變化的相關(guān)因素。 4．觀察CTX對(duì)不同月齡大鼠卵巢功能的影響。 研究?jī)?nèi)容與方法 1．研究對(duì)象： 60只清潔級(jí)成年Spragne-Dawley(SD)雌性大鼠，鼠齡60～70天，體重230±10g；36只清潔級(jí)未成年(SD)雌性大鼠，鼠齡3周，體重50±5g，均購(gòu)自中山

5、大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK(粵)2004-0011。給予標(biāo)準(zhǔn)光照(14小時(shí)光照、10小時(shí)黑夜)，全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，室溫20-25℃，相對(duì)濕度45～55％。 2．研究方法： 2．1 大鼠卵巢功能損害模型的建立 60只60～70天的清潔級(jí)成年雌性SD大鼠分為空白對(duì)照組(生理鹽水組)和環(huán)磷酰胺(CTX組)分別于用藥后3天、1周、2周、4周、8周觀察動(dòng)情周期、稱(chēng)取卵巢重量、進(jìn)行卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡

6、計(jì)數(shù)、測(cè)定血清E<,2>、FSH，評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能，從而建立大鼠卵巢功能損害模型。 2．2 分組與用藥 2．2．1 將進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的60只60～70天的清潔級(jí)成年雌性SD大鼠隨機(jī)分成2組：空白對(duì)照組和CTX組，即Ⅰ組和Ⅱ組。每組30只。 Ⅰ組(空白對(duì)照組)：用0.9％生理鹽水腹腔注射1ml一次，以上動(dòng)物均在用藥后每日定時(shí)取陰道分泌物涂片觀察動(dòng)情周期，分別于用藥后3天、1周、2周、4周、8周于動(dòng)情期處死動(dòng)物，分為Ⅰ A

7、組、Ⅰ B組、Ⅰ C組、Ⅰ D組、Ⅰ E組，每組均為6只。取血清置入-80℃冰箱待測(cè)。取左側(cè)卵巢稱(chēng)取濕重后，左側(cè)卵巢送病理檢查。Ⅱ組(CTX組)：CTX 75mg/kg腹腔注射一次。處理同上，分為ⅡA組、ⅡB組、Ⅱ C組、Ⅱ D組、Ⅱ E組，每組均為6只。 2．2．2 將進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的36只3周齡清潔級(jí)未成年雌性SD大鼠隨機(jī)分成2組：空白對(duì)照組(生理鹽水組)和環(huán)磷酰胺(CTX)組，即Ⅲ組和Ⅳ組，每組18只。 Ⅲ組(空白對(duì)照組

8、)：用0.9％生理鹽水腹腔注射0.6ml一次，分別于用藥后3天、1周、2周處死動(dòng)物，分為ⅢA組、ⅢB組、ⅢC組，每組為6只。取血清置入-80℃冰箱待測(cè)。取左側(cè)卵巢稱(chēng)取濕重后，左側(cè)卵巢送病理檢查。 Ⅳ組(CTX組)：CTX 100mg/kg腹腔注射一次。處理同上，分為ⅣA組、ⅣB組、ⅣC組，每組均為6只。 2．3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo) 2．3．1 大鼠動(dòng)情周期的觀察：取陰道分泌物涂片蘇木素伊紅染色后鏡檢。 2．3．

9、2 卵巢重量的影響：取左側(cè)卵巢，以電子稱(chēng)稱(chēng)重。 2．3．3 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡計(jì)數(shù)：病理切片為連續(xù)5μm切片，每間隔9張取一張切片(即第10張)，計(jì)算卵泡數(shù)，累積計(jì)數(shù)每個(gè)卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡數(shù)目。 2．3．4 大鼠血清E<,2>、FSH的測(cè)定：采用雙抗體夾心ELISA法。 結(jié)果 1．本研究成年ⅡA組、ⅡB組、ⅡC組、ⅡD組、ⅡE卵巢原始卵泡數(shù)分別與對(duì)照組比較，原始卵泡數(shù)均減少，

10、差異有顯著性(p<0.05)。成年ⅡA組、ⅡB組、Ⅱ C組初級(jí)卵泡數(shù)、生長(zhǎng)卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)分別與對(duì)照組比較，初級(jí)卵泡、生長(zhǎng)卵泡、成熟卵泡數(shù)增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。成年ⅡA組、Ⅱ B組、ⅡC組、ⅡD組血清E<,2>分別與對(duì)照組比較，血清E<,2>降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。成年ⅡA組、ⅡB組血清FSH分別與對(duì)照組比較，血清FSH升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。成年CTX組大鼠第1、2周陰道涂片顯示動(dòng)情周期發(fā)生改變

11、，規(guī)則的動(dòng)情周期變化消失，周期延長(zhǎng)為8～17天，絕大多數(shù)停止于動(dòng)情間期。成年ⅡB組、ⅡC組、ⅡD組、ⅡE組卵巢重量分別與對(duì)照組比較，卵巢重量減輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。顯示，CTX 75mg/kg腹腔注射一次，用藥后3天、1周、2周卵巢功能均受到損害，CTX對(duì)大鼠卵巢功能損害的模型建模成功。 2．CTX對(duì)未成年大鼠卵巢功能的影響：未成年ⅣC組大鼠卵巢初級(jí)卵泡數(shù)減少，ⅣB組生長(zhǎng)卵泡數(shù)增加，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.

12、05)。ⅣA組、ⅣB組、ⅣC組原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)與對(duì)照組比較，兩者差異無(wú)顯著性意義(p>0.05)，ⅣB組血清E<,2>、FSH 與對(duì)照組比較，血清E<,2>降低，F(xiàn)SH升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，而未成年ⅣA組、ⅣC組血清E<,2>、FSH與對(duì)照組比較，兩者差異無(wú)顯著性意義(p>0.05)。ⅣC組大鼠卵巢重量減輕，與對(duì)照組比較，兩者差異有顯著性意義(p<0.05)，ⅣA組、ⅣB組大鼠卵巢重量分別與對(duì)照組比較，兩者差異無(wú)顯著

13、性意義(p>0.05)。 結(jié)論 1．本研究采用CTX 75mg/kg單次腹腔注射用藥建立CTX對(duì)卵巢功能損害的大鼠模型，成本低，手術(shù)操作簡(jiǎn)便，建模成功率高，對(duì)于研究化療引起卵巢功能損害的機(jī)理、卵巢功能保護(hù)等是良好的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2．本研究結(jié)果顯示CTX作用下卵巢形態(tài)學(xué)改變最顯著的是原始卵泡數(shù)目減少，提示這可能是其減少卵巢儲(chǔ)備量，致卵巢功能受損的主要機(jī)制之一。 3．本研究結(jié)果提示卵巢功能損害與大鼠月齡關(guān)系