TBX20基因在單純性先天性心臟病中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　先天性心臟病(Congenital Heart Disease，CHD)是一種常見的先天畸形，在新生兒中的發(fā)病率為1％～2％，占新生兒非感染性死亡的首位。其中約有80％僅表現(xiàn)為心臟畸形，而不伴有其它系統(tǒng)的先天異常，稱之為單純性先天性心臟病(simplecongenital heart disease)。臨床資料和流行病學(xué)研究表明，遺傳因素在CHD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，遺傳率為55％～65％，但其遺傳方式、外顯率等均

2、不清楚，致病基因尚未確定。
　　心臟發(fā)育是胚胎發(fā)育的早期事件，涉及到不同時間、不同空間相關(guān)分子的先后表達(dá)和相互作用。參與心臟發(fā)育的主要有四類分子:信號分子、細(xì)胞粘附分子、離子通道分子和轉(zhuǎn)錄因子，其中轉(zhuǎn)錄因子是現(xiàn)在研究最多的，如TBX5、TBX1、NKX2-5、GATA4、HAND1、TWIST、MEF2C等。這些轉(zhuǎn)錄因子之間通過DNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成精確而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中任一轉(zhuǎn)錄因子的改變都會影響正常的調(diào)控

3、網(wǎng)絡(luò)，引起心臟的異常發(fā)育而導(dǎo)致CHD發(fā)生。
　　TBX20(T-box20)基因?qū)儆赥-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員（TBX1亞家族），編碼一類具有T-box DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，作為轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子調(diào)控機(jī)體正常發(fā)育。動物實(shí)驗(yàn)表明，Tbx20在心臟祖細(xì)胞、發(fā)育心肌以及心內(nèi)膜墊相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，利用RNA干擾技術(shù)使Tbx20水平降低會導(dǎo)致心臟流出道和右室嚴(yán)重受損等心血管系統(tǒng)發(fā)育異常。在人類CHD患者中，研究人員已先后報道了TBX

4、20基因的錯義突變、無義突變和插入突變，提示TBX20基因是重要的CHD易感基因。
　　本課題組前期將單純性CHD易感基因初步定位于7p14-15，而TBX20基因正好位于此染色體區(qū)域內(nèi)。結(jié)合他人研究結(jié)果，我們認(rèn)為:TBX20基因很可能是該染色體區(qū)域內(nèi)單純性CHD重要候選基因。因此，本研究首先選擇TBX20基因內(nèi)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNP)進(jìn)行SNP關(guān)聯(lián)分析;其次鑒定單純性CHD患者TBX20基因的突變或多態(tài)，并通過螢光素酶

5、報告系統(tǒng)、電泳泳動遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等進(jìn)行功能研究;最后檢測單純性CHD患者TBX20基因表達(dá)，并通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)闡明抑制TBX20基因表達(dá)對心肌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為揭示TBX20基因在單純性CHD中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　標(biāo)本
　　本研究已收集的單純性CHD標(biāo)本均已簽署知情同意書，并經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)通過。
　　210個單純性CHD核心家系

6、、200例單純性CHD患者和200例正常對照由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、盛京醫(yī)院和沈陽軍區(qū)總院提供。所有單純性CHD患者均具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)心臟超聲和手術(shù)確診。
　　12例單純性CHD患兒及12例正常對照心肌組織標(biāo)本由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院和沈陽軍區(qū)總院提供。
　　1、TBX20基因SNP關(guān)聯(lián)分析
　　從HapMap數(shù)據(jù)庫選擇TBX20基因內(nèi)標(biāo)簽SNP: rs336283，通過PCR-RFLP進(jìn)行基因分型，應(yīng)用ETD

7、T軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
　　2、TBX20基因突變篩查
　　應(yīng)用PCR結(jié)合DNA測序進(jìn)行TBX20基因突變篩查。
　　3、c.-283G＞A多態(tài)與單純性CHD的關(guān)聯(lián)分析
　　通過PCR-RFLP進(jìn)行c.-283G＞A多態(tài)基因分型，應(yīng)用ETDT軟件和CLUMP軟件進(jìn)行核心家系和病例-對照關(guān)聯(lián)分析。
　　4、c.-283G＞A多態(tài)對心肌組織TBX20基因表達(dá)的影響
　　應(yīng)用RT-PCR和Western Bl

8、ot檢測心肌組織TBX20基因表達(dá)，并通過PCR-RFLP進(jìn)行c.-283G＞A多態(tài)的基因分型。
　　5、c.-283G＞A多態(tài)對TBX20基因啟動子活性的影響
　　分別構(gòu)建攜帶c.-283G＞A多態(tài)不同等位基因的TBX20基因啟動子螢光素酶報告載體，應(yīng)用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析啟動子活性。
　　6、c.-283G＞A位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件的鑒定
　　應(yīng)用P-Match軟件，對TBX20基因啟動子區(qū)c.-283G＞A位

9、點(diǎn)附近序列進(jìn)行預(yù)測，尋找潛在的轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件。分別應(yīng)用電泳泳動遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)鑒定c.-283G＞A位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件。
　　7、ZIC3對TBX20基因啟動子活性的影響
　　共轉(zhuǎn)染ZIC3表達(dá)載體pZIC3和攜帶c.-283G＞A多態(tài)不同等位基因的TBX20基因啟動子螢光素酶報告載體，應(yīng)用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析啟動子活性。
　　8、ZIC3過表達(dá)和表達(dá)抑制
　　ZIC3表達(dá)載體

10、或ZIC3特異性siRNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Real-time PCR檢測TBX20、BMP2和ISL1基因mRNA表達(dá)水平。
　　9、TBX20基因表達(dá)分析
　　應(yīng)用RT-PCR和Western Blot檢測CHD患者心肌組織TBX20基因表達(dá)。
　　10、RNA干擾
　　大鼠Tbx20基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9c2，人TBX20基因特異性shRNA轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293，應(yīng)用Real-t

11、ime PCR和Western Blot檢測靶基因表達(dá)。
　　11、干擾TBX20基因表達(dá)后心肌細(xì)胞生物學(xué)特性分析
　　采用CCK8活細(xì)胞染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，檢測細(xì)胞增殖;采用PI單染法測定細(xì)胞周期，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測細(xì)胞周期標(biāo)志物Cyclin B1和P27基因mRNA表達(dá);應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析早期凋亡指標(biāo)，TUNEL方法檢測晚期凋亡指標(biāo)。
　　12、凋亡相關(guān)基因的鑒定
　　應(yīng)用細(xì)胞凋亡PCR芯

12、片篩選凋亡相關(guān)基因，并通過Real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測T-box結(jié)合位點(diǎn)，并應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)的存在。
　　13、TBX20基因表達(dá)抑制對心肌marker的影響
　　Real-time PCR方法檢測干擾TBX20基因表達(dá)后心肌marker GATA4和NKX2-5的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、TBX20基因與單純性CHD相關(guān)TBX20基因內(nèi)tagSNP關(guān)聯(lián)分

13、析顯示TBX20基因與單純性CHD相關(guān)(x2=5.17，P＜0.05)。
　　2、在TBX20基因啟動子鑒定了新的多態(tài)c.-283G＞A
　　雖然在單純性CHD患者外周血和心肌組織中并沒有發(fā)現(xiàn)TBX20基因的致病突變，但在TBX20基因啟動子鑒定了新的多態(tài)c.-283G＞A。病例-對照研究顯示A等位基因攜帶者患單純性CHD的風(fēng)險高于G等位基因攜帶者(OR=1.745，95％ CI1.076～2.829，P=0.023)。核心

14、家系分析顯示A等位基因從正常雜合子雙親傳遞給患者后代的頻率遠(yuǎn)大于預(yù)期值(x2=7.20，P=0.007)，提示A等位基因能夠增加單純性CHD患病風(fēng)險。
　　3、c.-283G＞A多態(tài)影響心肌組織TBX20基因表達(dá)
　　GA型心肌組織內(nèi)TBX20基因表達(dá)明顯低于GG型心肌組織(P＜0.01)。
　　4、c.-283G＞A多態(tài)影響TBX20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性
　　與pGL-283G相比，pGL-283A螢光素酶活性顯

15、著降低(P＜0.05)。
　　5、c.-283G＞A多態(tài)影響轉(zhuǎn)錄因子ZIC3結(jié)合親和力
　　生物信息學(xué)軟件預(yù)測，c.-283G＞A位點(diǎn)G→A的改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ZIC3結(jié)合位點(diǎn)消失。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和電泳泳動遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)實(shí)驗(yàn)分別在體內(nèi)、體外條件下鑒定了ZIC3與c.-283G型TBX20基因啟動子區(qū)的結(jié)合。
　　6、ZIC3劑量依賴性上調(diào)c.-283G型TBX20基因啟動子活性
　　pZIC3與p

16、GL-283G共轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性上升(P＜0.01)，而pZIC3與pGL-283A共轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性無變化。轉(zhuǎn)錄激活子ZIC3對c.-283G型TBX20基因啟動子活性的調(diào)控呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　7、ZIC3對TBX20基因的正調(diào)控是通過BMP2基因發(fā)揮作用
　　過表達(dá)ZIC3上調(diào)TBX20基因和BMP2基因表達(dá)（P＜0.05），對ISL1基因表達(dá)無影響;抑制ZIC3表達(dá)下調(diào)TBX20基因和BMP2基因表達(dá)(P＜0.0

17、5)，對ISL1基因表達(dá)無影響。
　　結(jié)論：
　　1、TBX20基因與單純性CHD相關(guān)。
　　2、TBX20基因突變可能不是TBX20基因參與單純性CHD發(fā)生的可能途徑。
　　3、TBX20基因啟動子區(qū)新的c.-283G＞A多態(tài)為功能性多態(tài)，通過影響轉(zhuǎn)錄因子ZIC3的結(jié)合親和力而降低TBX20基因表達(dá)，提高單純性CHD患病風(fēng)險。
　　4、ZIC3是TBX20基因的轉(zhuǎn)錄激活子，以劑量依賴方式正調(diào)控TBX20基

18、因的表達(dá)，并通過TBX20-BMP2通路發(fā)揮作用。
　　5、TBX20基因在單純性CHD患者心肌組織的表達(dá)降低。
　　6、TBX20基因表達(dá)抑制能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G2期。
　　7、TBX20基因負(fù)調(diào)控促凋亡基因LTA表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　8、TBX20基因調(diào)控Cyclin B1基因和P27基因表達(dá)，參與心肌細(xì)胞增殖。
　　9、TBX20基因負(fù)調(diào)控心肌marke