Fibulin-5在人膀胱腫瘤中表達(dá)水平及其表達(dá)載體作用于膀胱癌細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，手術(shù)結(jié)合局部化療為其主要的治療方式。雖然近幾年來對膀胱癌的研究取得了很大進(jìn)展，但是其診斷和治療效果依然不能令人滿意，尤其是易復(fù)發(fā)、晚期和伴有轉(zhuǎn)移的膀胱癌。因此對膀胱癌的診斷和治療要想取得好的效果，必須對膀胱癌的上述生物學(xué)特性進(jìn)行深入的研究。發(fā)現(xiàn)各種能早期診斷膀胱腫瘤的腫瘤標(biāo)志物及抑癌基因是改進(jìn)目前治療方案的重要手段。Fibulin-5是最新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，在多種癌組織中表達(dá)有下調(diào)，但Fibulin-

2、5在膀胱腫瘤中的表達(dá)水平及其對膀胱腫瘤發(fā)生發(fā)展所起到的作用目前仍未有闡明。
　　 目的：
　　 初步闡明Fibulin-5在膀胱腫瘤中起到的作用及作為膀胱腫瘤標(biāo)志物的潛在意義。
　　 在膀胱尿路上皮癌組織中檢測Fibulin-5的表達(dá)水平是否有變化，并通過上調(diào)Fibulin-5表達(dá)水平來檢測其對細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力的作用。
　　 方法：
　　 1.采用Western-blot法檢測Fibuli

3、n-5蛋白在20例尿路上皮癌和7例正常膀胱粘膜組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。
　　 2.Fibulin-5基因cDNA 序列由日本Dr.Tomoyuki Nakamura 教授所贈(zèng)，首先將該序列克隆到T載體pMD-19T中，通過酶切鑒定和DNA 測序鑒定正確與否。然后將pMD-19T-Fibulin-5載體的cDNA 進(jìn)一步構(gòu)建到p-EGFP-n1 載體中，酶切位點(diǎn)為XhoIand EcoRI，再采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將構(gòu)

4、建好的表達(dá)載體p-EGFP-F5轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞5637中，熒光下觀測轉(zhuǎn)染效率，流式細(xì)胞儀進(jìn)一步分選，形成轉(zhuǎn)染效率90[％]以上的細(xì)胞群，再進(jìn)一步用G418 篩選，形成穩(wěn)定表達(dá)克隆。
　　 3 .針對穩(wěn)定表達(dá)的克隆5637細(xì)胞，使用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及transwell 侵襲小室法分別檢測Fibulin-5表達(dá)上調(diào)后膀胱癌細(xì)胞生長速率、遷移及侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　

5、1.W estern-blot法檢測結(jié)果表明Fibulin-5蛋白在膀胱腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在低度和高度惡性腫瘤中分別為0.57±0.11和0.44±0.16(mean±SEM)，和正常膀胱粘膜組織的表達(dá)水平1.16±0.11 比明顯下調(diào)(P=0.001 and P=0.001)，但是高度惡性腫瘤和低度惡性腫瘤之間卻無顯著性差異(P=0.423)。
　　 2.通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT法測得穩(wěn)定表達(dá)Fibulin-5蛋白的人膀胱腫瘤563

6、7細(xì)胞的生長速率明顯低于對照組(P<0.05)。
　　 3.穩(wěn)定表達(dá)Fibulin-5蛋白的人膀胱腫瘤5637細(xì)胞侵襲能力明顯低于空白基因?qū)φ战M和未轉(zhuǎn)染對照(分別為P=0.001和P<0.001)，而遷移能力雖低于對照但卻無顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Fibulin-5在膀胱腫瘤中表達(dá)有下調(diào)，可能是判斷膀胱癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。
　　 2.成功構(gòu)建的Fibulin-5真核表達(dá)載體