枯草溶菌素轉(zhuǎn)換酶9基因新突變的發(fā)現(xiàn)及其功能初步研究.pdf

1、研究背景：
　　家族性高膽固醇血癥(familia hypercholesterlolemia, FH)是顯性遺傳代謝性疾病,可由多種脂代謝相關(guān)基因突變所導(dǎo)致。家系遺傳分析研究證實(shí)低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDL-R)、枯草溶菌素轉(zhuǎn)換酶9(proprotein convertase subtilisin kexin9,PCSK9)等基因突變引發(fā)LDL-R功能障礙均可導(dǎo)致相同

2、的臨床表型:純合子發(fā)病率1/百萬(wàn),血漿LDL膽固醇大幅度增高導(dǎo)致早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化,兒童期即可導(dǎo)致嚴(yán)重的冠心病而死亡。雜合子發(fā)病率1/500,出生時(shí)即有 LDL-R的功能障礙,機(jī)體長(zhǎng)期暴露于高膽固醇水平,動(dòng)脈硬化進(jìn)展加速。通常50％男性患者在50歲之前、30%女性在60歲之前發(fā)生心梗,在小于60歲的心梗患者FH雜合子患者中約占5%。在已知的致病基因中LDL-R基因突變最為常見(jiàn),約占FH病例的50%-70%,其它5種突變約占20%。然而,在

3、FH患者中仍有約10-15%檢測(cè)不到上述6種致病基因突變,推測(cè)尚有一些新的致病基因有待發(fā)現(xiàn)
　　隨著近年對(duì)PCSK9基因研究的不斷深入,人們對(duì)LDL-膽固醇的代謝機(jī)制又有了新的認(rèn)識(shí)。最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCSK9基因?qū)DL-R代謝有重要調(diào)節(jié)作用;同為 PCSK9基因的不同位點(diǎn)突變可導(dǎo)致完全相反的兩種現(xiàn)象:PCSK9功能獲得性突變與高膽固醇血癥有關(guān);PCSK9功能喪失突變與低膽固醇血癥有關(guān)。本課題從一個(gè)FH家系入手,篩查致病突變,并于

4、體外研究突變體功能,探討該突變體作用機(jī)制,為高膽固醇血癥的臨床診斷及脂質(zhì)代謝的機(jī)制提供新的線索。
　　第一部分：家族性高膽固醇血癥患者臨床資料分析及基因突變篩查
　　[目的]：
　　篩查中國(guó)漢族家族性高膽固醇血癥家系中的基因突變新類型,分析基因型與表型間的關(guān)系。
　　[方法]：
　　以一 FH家系為研究對(duì)象,詳細(xì)調(diào)查患者飲食、生活習(xí)慣及家族史并進(jìn)行心血管系統(tǒng)全面檢查;提取外周血白細(xì)胞 DNA,核苷酸序列測(cè)定

5、法對(duì)一個(gè)漢族FH家系 LDL-R、apoB和PCSK9基因進(jìn)行突變檢測(cè);采用蛋白分析系統(tǒng)ExPASy預(yù)測(cè)PCSK9基因野生型和R306S突變體編碼蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　[結(jié)果]：
　　1、該FH家系先證者體檢顯示心血管系統(tǒng)嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化性改變,心臟缺血性損傷;2、LDL-R和apo B100基因未見(jiàn)突變;核苷酸序列測(cè)定法發(fā)現(xiàn)先證者及其父親PCSK9基因第918位核苷酸G T改變,導(dǎo)致第6外顯子第306位精基酸被絲氨酸取

6、代;3、蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬發(fā)現(xiàn),與野生型相比, PCSK9基因發(fā)生R306S突變后編碼蛋白梭基末端結(jié)構(gòu)域和催化亞基結(jié)構(gòu)域兩個(gè)主要的部分構(gòu)像發(fā)生改變,且這2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的距離拉大。
　　[結(jié)論]：
　　1.在一漢族FH家系中發(fā)現(xiàn)PCSK9基因新錯(cuò)義突變R306S;
　　2.計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬分析發(fā)現(xiàn)新突變體 R306S編碼蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
　　第二部分：枯草溶菌素轉(zhuǎn)換酶9基因新突變體表達(dá)及功能初步研究<

7、br>　　[目的]：
　　探討枯草溶菌素轉(zhuǎn)換酶9基因新突變對(duì)LDL代謝的作用及突變致FH的分子機(jī)制,并為突變患者采取早期治療,防治心血管疾病發(fā)生和擴(kuò)展LDL的代謝機(jī)制等提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]：
　　從人肝腫瘤細(xì)胞系 BEL-7402細(xì)胞獲得野生型 PCSK9基因全長(zhǎng)cDNA(WT-PCSK9);構(gòu)建真核表達(dá)載體并經(jīng)核苷酸序列測(cè)定法鑒定;定點(diǎn)突變方法構(gòu)建攜帶PCSK9基因致病型的重組真核表達(dá)質(zhì)粒并測(cè)序及酶切法

8、鑒定插入片段的大小及序列;以空白載體為對(duì)照,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞;RT-PCR檢測(cè)LDL-R mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)PCSK9和LDL-R蛋白表達(dá);荷脂實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)LDL代謝的影響;免疫熒光觀察PCSK9基因與LDL-R細(xì)胞共定位;流式細(xì)胞法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞LDL-R對(duì)熒光標(biāo)記LDL的結(jié)合能力的變化;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系,建立Tet on/off系統(tǒng),定量觀察PCSK9基因?qū)DL-R表達(dá)的影響。

9、r>　　[結(jié)果]：
　　1、核苷酸序列測(cè)定法鑒定證實(shí)構(gòu)建的表達(dá)載體插入片段大小和序列正確。2、各突變體轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞LDL-R mRNA水平與野生型比較無(wú)明顯差異(p>0.05)。3、Western blot檢測(cè)各突變體轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞PCSK9前體蛋白和成熟蛋白無(wú)明顯差異(p>0.05);與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染野生型PCSK9質(zhì)粒后LDL-R成熟蛋白表達(dá)降低(p<0.05);轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒后成熟LDL-R條帶消失

10、表達(dá)明顯降低( p<0.01);轉(zhuǎn)染 R306S突變體后成熟 LDL-R降低(p<0.01)。4、荷脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照相比,PCSK9野生型肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)減少(p<0.05);R306S組肝細(xì)胞脂質(zhì)減少明顯(p<0.01),且低于野生型PCSK9 BEL肝細(xì)胞(p<0.05)。5、免疫熒光檢測(cè)肝細(xì)胞PCSK9與LDL-R共定位,轉(zhuǎn)染前后分別主要位于細(xì)胞膜和胞內(nèi)。6、流式細(xì)胞法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞LDL-R對(duì)熒光標(biāo)記 LDL的結(jié)合活性的變化

11、,與空白對(duì)照組細(xì)胞相比野生型PCSK9組熒光強(qiáng)度降低(p<0.05),陽(yáng)性對(duì)照F216R組平均熒光降低更為明顯(p<0.01),新突變體組平均熒光強(qiáng)度降低程度較野生型明顯(p<0.01)。7、突變體Tet on系統(tǒng)在BEL-7402細(xì)胞中高效、穩(wěn)定表達(dá)。在PCSK9野生型及突變體Tet on系統(tǒng)中隨著Doxycycline藥物濃度的增加,PCSK9野生型和突變體開(kāi)始表達(dá),且表達(dá)量逐漸升高,LDL-R成熟蛋白部分逐漸減少,未糖基化的LDL

12、-R未見(jiàn)顯著變化;與野生型相比,R306S降低成熟LDL-R的能力顯著提高(p<0.05)。
　　[結(jié)論]：
　　1.成功構(gòu)建PCSK9基因野生和突變類型的真核表達(dá)載體;
　　2.體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PCSK9基因新突變體R306S對(duì)LDL-R的轉(zhuǎn)錄無(wú)顯著影響;
　　3.PCSK9基因新突變體R306S可明顯降低細(xì)胞LDL-R成熟蛋白水平;
　　4.PCSK9基因新突變體R306S可減少其對(duì)LDL的攝取從而引發(fā)高