TMEM43基因定點突變克隆構建及其功能初步分析.pdf

1、目的:通過構建TMEM43基因點突變真核表達載體，并將TMEM43基因點突變真核表達載體轉染細胞，觀察真核表達情況，同時采用生物信息學方法分析TMEM43基因的生物學功能，然后分析轉染野生型與突變型TMEM43心肌細胞的細胞生長和細胞凋亡狀況。
　　方法：:通過克隆PCR、酶切和定向連接等DNA重組技術構建真核表達質粒載體pTMEM43-EGFP-N1。表達載體pTMEM43-EGFP-N1用SDM定點突變技術構建TMEM43點突

2、變真核表達載體p-mutTMEM43-EGFP-N1。將野生型和突變型TMEM43基因克隆分別轉化DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經卡那霉素抗性篩選陽性菌落，挑取陽性菌落，培菌擴增，小制備方法提取質粒DNA，并純化質粒DNA。經Age I和Xho I單酶切或雙酶切，根據(jù)酶切后DNA電泳結果剔除假陽性克隆。經酶切鑒定后的陽性克隆進行PCR測序反應，測序PCR反應產物經純化后，用測序儀進行核苷酸測序。經測序的序列經比對后確認TMEM43基因點

3、突變的發(fā)生。將測序證實的點突變克隆轉化感受態(tài)細菌，擴菌后，用大提法制備去除內毒素的野生型和突變型跨膜蛋白TMEM43克隆質粒，備用。小鼠心肌細胞株HL-1細胞用含10％胎牛血清的Claycomb培養(yǎng)基培養(yǎng)，經胰蛋白酶消化和更新培養(yǎng)基后進行HL-1細胞的傳代培養(yǎng)。用于顯微觀察的細胞貼附生長于小玻片上，應用Lipofectamine2000轉染試劑，將野生型和突變型TMEM43分別轉染HL-1細胞株，24小時后，在熒光顯微鏡下觀察小玻片上H

4、L-1細胞的質粒轉染情況。用于蛋白免疫印跡分析的細胞，傳代培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，細胞經轉染后24-36小時，用細胞刮子收集貼附生長細胞，裂解液裂解細胞提取總蛋白。采用生物信息學的方法分析TMEM43蛋白質的與結構、點突變效應預測等。分別用MTT法和流式細胞術觀察轉染野生型和突變型TMEM43的HL-1細胞增殖和細胞凋亡情況。
　　結果：
　　1．構建的真核表達載體pTMEM43-EGFP-N1的酶切鑒定結果符合預期，即Age I和

5、Xho I單酶切產生大小為5.7kb左右的線型DNA片斷，而Age I和Xho I雙酶切則產生大小分別為4.3kb和1.3kb的線型DNA片斷。
　　2．對含有野生型TMEM43基因的質粒pTMEM43-EGFP-N1通過定點突變技術，經突變誘導PCR后，經Dpn酶消化、細菌轉化和篩選，對質粒DNA用Xho I限制酶消化，電泳后結果顯示，突變體DNA產生清晰的大小為5.7kb的片斷。
　　3．將突變體轉化感受態(tài)大腸桿菌后，接

6、種于青霉素和卡那霉素雙選培養(yǎng)板，經37℃孵育18小時后挑取陽性菌落。陽性菌落經液體培養(yǎng)基擴菌后，用小提質粒DNA方法提取質?；蚪MDNA，經酶切后電泳結果顯示有3個菌落符合預期。
　　4．對符合預期的質粒進行測序鑒定，測序結果證實C>T的生成。
　　5．經過酶切和測序鑒定證實的突變體p-mutTMEM43-EGFP-N1繼續(xù)進行大量擴增和采用大提質粒DNA的方法提取不含內毒素和致熱原的DNA，經酶切確認，再進行質粒全基因組測

7、序，結果顯示序列全部正確。
　　6．應用Lipofectamine2000轉染試劑分別用野生型TMEM43和突變型TMEM43質粒轉染小鼠心肌來源的細胞株HL-1細胞，在熒光顯微鏡下觀察到野生型和突變型均能夠成功轉染細胞，兩者在在細胞內定位沒有明顯差異。
　　7．對轉染質粒后的細胞蛋白進行免疫印跡分析，結果顯示，野生型和突變型TMEM43均有良好的表達。
　　8．細胞增殖檢測結果顯示，野生型與突變型TMEM43轉染細胞

8、后，細胞增殖沒有顯著差異。
　　9．流式細胞術檢測分別轉染野生型和突變型TMEM43基因的HL-1細胞，轉染突變型的細胞凋亡水平顯著高于轉染野生型的細胞。蛋白質印跡分析結果顯示，轉染突變型TMEM43基因的細胞，凋亡相關蛋白Bax表達水平增加，而Bcl2蛋白表達水平降低。
　　結論：
　　1.在TMEM43基因中成功誘導產生了1073C>T點突變。
　　2.構建的真核表達載體可有效轉染真核細胞，轉染突變型TMEM