小麥TaRCR1和TaAGC1基因在防御紋枯病反應(yīng)中的功能與作用機制研究.pdf

1、近年來，由于氣候變暖、耕作制度和種植密度的改變，由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）引起的小麥紋枯?。╳heat sharp eyespot），已發(fā)展為我國主要的病害，連續(xù)十多年發(fā)病面積超過一億畝，損失嚴(yán)重。生產(chǎn)上抗紋枯病小麥品種匱乏，因此分離克隆抗紋枯病相關(guān)基因，研究其功能和作用機制，為抗紋枯病小麥育種提供基因和理論支撐，具有重要意義。NB-LRR類蛋白和蛋白激酶是植物抗病反應(yīng)中兩種重要的蛋白。本研究主要以紋枯病誘

2、導(dǎo)的一個小麥NB-LRR類蛋白編碼基因TaRCR1和一個蛋白激酶基因TaAGC1過表達的小麥和沉默表達的小麥為實驗材料，研究了這兩個基因在小麥抗紋枯病反應(yīng)中功能和作用機制。
　　TaRCR1編碼NB-LRR類蛋白，參與小麥對紋枯病菌的防御反應(yīng)。本研究繼續(xù)對TaRCR1基因的分子生物學(xué)特性、抗病功能和作用機制進行了研究，主要結(jié)果如下：
　　（1）TaRCR1受紋枯菌誘導(dǎo)表達，在接種紋枯菌7天后達到表達高峰，并且在根和莖中的表達

3、量高于葉和穗中的表達量。
　?。?）利用PEG介導(dǎo)GFP-TaRCR1融合蛋白在小麥原生質(zhì)體中瞬時表達,進行亞細胞定位分析，結(jié)果顯示TaRCR1分布于小麥的胞質(zhì)和細胞核中。
　?。?）利用PCR、qRT-PCR和Western blot技術(shù)，對轉(zhuǎn)TaRCR1基因小麥T2-T4代植株進行轉(zhuǎn)基因分子特征分析，結(jié)果表明，在6個轉(zhuǎn)基因小麥株系中轉(zhuǎn)入的TaRCR1能夠遺傳、轉(zhuǎn)錄和過量表達；對TaRCR1過表達轉(zhuǎn)基因小麥株系和未轉(zhuǎn)基因小

4、麥揚麥16（受體）接種紋枯菌進行抗病性鑒定，結(jié)果表明TaRCR1基因的過表達提高了小麥對紋枯病的抗性。
　　（4）應(yīng)用大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技術(shù)，摩擦接種BSMV:TaRCR1病毒，以沉默抗紋枯病小麥CI12633中TaRCR1基因的表達，再接種紋枯病菌進行抗病程度分析，結(jié)果說明TaRCR

5、1基因表達量的降低，減弱了寄主小麥對紋枯病的抗性。
　?。?）利用qRT-PCR分析14個防御相關(guān)基因在TaRCR1基因過表達小麥和受體揚麥16以及TaRCR1基因表達沉默和對照小麥植株中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明TaRCR1正向調(diào)控PR1、PR2、chitinase2和TaPIE1的表達水平，這四個防御相關(guān)基因的表達還受紋枯菌的誘導(dǎo)。
　?。?）H2O2和茉莉酸（jasmonic,JA）處理誘導(dǎo)TaRCR1基因的表達水平，且H2

6、O2預(yù)處理可以提高紋枯菌侵染對TaRCR1基因的誘導(dǎo)表達水平；TaRCR1所調(diào)控的PR1、PR2、chitinase2和TaPIE1基因也受H2O2的誘導(dǎo)表達。
　?。?）接種紋枯菌12 h后，TaRCR1正向調(diào)控CAT1、POX2等活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達以及過氧化物酶（peroxidase,POD）的活性，負向調(diào)控ROS合成關(guān)鍵基因NOX的轉(zhuǎn)錄表達；DAB和NBT染

7、色結(jié)果顯示，TaRCR1基因過量表達減弱了紋枯菌侵染引起的ROS積累；對轉(zhuǎn)TaRCR1基因小麥噴施POD合成的抑制劑NaN3降低了TaRCR1過表達植株對紋枯病的抗性，說明小麥體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡對于TaRCR1介導(dǎo)的紋枯病抗性非常重要，TaRCR1通過調(diào)控ROS相關(guān)基因的表達維持ROS的動態(tài)平衡，進而正向調(diào)控小麥對紋枯病的抗性反應(yīng)。
　?。?）利用Anti-c-Myc Agarose純化TaRCR1過表達小麥體內(nèi)總蛋白，用胰蛋白

8、酶進行酶解處理后進行質(zhì)譜分析，篩選到一個TaRCR1互作蛋白TaPP2Ac，酵母雙雜交實驗證明TaRCR1與TaPP2Ac相互作用；BSMV-VIGS實驗證明，TaPP2Ac的表達沉默提高了小麥對紋枯病的抗性；同時，TaPP2Ac的qRT-PCR分析結(jié)果顯示，TaPP2Ac在TaRCR1過表達小麥中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于受體小麥，而在TaRCR1基因表達沉默小麥植株中的表達水平顯著高于對照植株中，推測TaRCR1通過負調(diào)控TaPP2Ac基因

9、的表達水平提高小麥對紋枯病的抗性。
　　本課題組前期研究表明，一個小麥蛋白激酶基因TaAGC1的過量表達可以顯著增強轉(zhuǎn)基因小麥對紋枯病的抗性反應(yīng)，而該基因的表達沉默削弱了小麥對紋枯病的抗性。
　　本文對TaAGC1抗紋枯病作用的機制進行了研究，取得以下結(jié)果：
　?。?）TaAGC1響應(yīng)H2O2的脅迫，H2O2處理后TaAGC1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高且在處理后3 h達到表達高峰，這暗示TaAGC1基因可能參與H2O2信號轉(zhuǎn)

10、導(dǎo)路徑。
　?。?）DAB和NBT染色結(jié)果顯示，紋枯菌的侵染誘導(dǎo)小麥植株產(chǎn)生大量的ROS（H2O2和O2?），TaAGC1基因過表達可以降低紋枯菌侵染引起的過量ROS的積累水平。qRT-PCR分析結(jié)果表明ROS消除相關(guān)基因POX2、CAT1和SOD3在TaAGC1過表達株系中的表達量顯著上調(diào)，而其在TaAGC1沉默表達植株中的表達量明顯降低；ROS合成關(guān)鍵基因NOX的表達模式與以上3個基因的相反，即在TaAGC1過表達中表達量最低