MALAT1在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的功能與機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。MALAT1是一個(gè)在哺乳動(dòng)物高度保守的lncRNA，主要與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前不清楚它是否參與免疫反應(yīng)。本課題旨在揭示MALAT1在炎癥應(yīng)答反應(yīng)中的作用及機(jī)制，進(jìn)一步豐富LncRNA在炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用。
　　方法:
　　為了驗(yàn)證MALAT1在炎癥反應(yīng)中的作用，我們主要以PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，qPC

2、R檢測(cè)了經(jīng)TLR4(Toll-like receptor4)配體LPS(Lipopolysaccharide)刺激后THP-1巨噬細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)變化。我們通過(guò)qPCR及ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了siRNA敲減MALAT1后對(duì)炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β表達(dá)的影響。我們進(jìn)行了NF-κB報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)MALAT1對(duì)NF-κB活性的影響。通過(guò)qPCR以及Western blot檢測(cè)了MALAT1對(duì)p50、p65表達(dá)豐度的影響

3、以及ChIP-qPCR檢測(cè)了敲減MALAT1對(duì)NF-κB與靶基因TNFα、IL-6和IL-1β啟動(dòng)子結(jié)合的影響來(lái)確定MALAT1調(diào)節(jié)NF-κB活性的機(jī)制。通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MALAT1與NF-κB的結(jié)合情況。為了驗(yàn)證NF-κB對(duì)MALAT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們做了NF-κB抑制劑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了NF-κB對(duì)LPS誘導(dǎo)的MALAT1表達(dá)的作用。通過(guò)構(gòu)建MALAT1不同啟動(dòng)子片段的報(bào)告質(zhì)粒以及候選NF-κB位點(diǎn)突變質(zhì)粒進(jìn)行報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MALAT

4、1啟動(dòng)子上是否存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。最終通過(guò)ChIP檢測(cè)NF-κB與MALAT1啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　我們發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導(dǎo)MALAT1的表達(dá)，此外siRNA敲減MALAT1后促進(jìn)了炎癥因子TNFα、IL-6的表達(dá)，而對(duì)IL-1β的表達(dá)沒(méi)有影響。NF-κB報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示MALAT1能夠抑制NF-κB活性。然而，我們發(fā)現(xiàn)MALAT1不影響p50和p65的表達(dá)豐度。通過(guò)ChIP，RIP實(shí)驗(yàn)以及對(duì)MALAT1在細(xì)

5、胞中分布情況的分析，我們發(fā)現(xiàn)MALAT1在細(xì)胞核中與NF-κB的亞基p50、p65結(jié)合，抑制了NF-κB與TNFα和IL-6啟動(dòng)子的結(jié)合。此外，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB的抑制劑抑制了LPS誘導(dǎo)的MALAT1轉(zhuǎn)錄，暗示LPS誘導(dǎo)的MALAT1的轉(zhuǎn)錄依賴于NF-κB。我們還在MALAT1啟動(dòng)子上確認(rèn)了一個(gè)NF-κB的保守結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證明了NF-κB與MALAT1啟動(dòng)子結(jié)合，表明NF-κB對(duì)MALAT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　結(jié)