乳癌抑制基因Tob1的功能與輻射增敏作用研究.pdf

1、乳癌是女性最常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)、發(fā)病早期即可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，是危害女性健康的主要惡性疾病之一。乳癌的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及大量基因或基因以外的變化和眾多相互交通的細(xì)胞信號(hào)通路，這為人們尋找安全理想的乳癌診療方法帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。因此，對(duì)乳癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究一直是近年來(lái)乳癌研究中的主要方向之一。 腫瘤抑制基因主要的生物學(xué)功能是通過(guò)抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤的發(fā)生，其編碼蛋白產(chǎn)物主要參與對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)

2、控并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此外還可參與對(duì)細(xì)胞間粘附力、蛋白酶活性等與腫瘤侵襲性或轉(zhuǎn)移性相關(guān)的功能調(diào)節(jié)；腫瘤抑制基因的突變或其正常功能的改變往往引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致癌變。近年來(lái)對(duì)腫瘤抑制基因廣泛、深入的研究為乳癌的臨床診治提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，腫瘤抑制基因也因此成為乳癌發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 Tob1基因（transducer of ERBB2，1）屬于TOB/BTG抗增殖家族，已知該家族所有成員都具有抗細(xì)胞增殖活

3、性和細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控作用。眾多研究報(bào)道Tob1基因可通過(guò)對(duì)cyclin D1的表達(dá)調(diào)控參與對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控，并在多種人類腫瘤中均具有腫瘤抑制基因特征。然而Tob1在惡性腫瘤發(fā)生中的具體作用機(jī)制至今尚不完全清楚，其在乳癌發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)功能研究也未見報(bào)道。 本研究首先通過(guò)Western Blot法、Northern Blot法以及免疫組化染色法對(duì)多種人類乳癌細(xì)胞及乳癌組織中Tob1的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種乳腺腫瘤

4、細(xì)胞及多數(shù)乳癌組織中Tob1的表達(dá)水平均有不同程度的下降或缺失。采用MTT生存分析法發(fā)現(xiàn)由重組腺病毒介導(dǎo)的外源性Tob1能顯著抑制乳癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；而在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，Tob1的高水平表達(dá)還可以顯著抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)以及腫瘤新生血管的形成。綜合體內(nèi)、體外以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首次證實(shí)Tob1在乳癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用。 隨后，為闡明Tob1發(fā)揮乳癌抑制功能的具體作用機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)分析了Tob1的高水平表達(dá)對(duì)細(xì)胞

5、周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示外源性Tob1可引起乳癌細(xì)胞中細(xì)胞周期G0/G1期以及G2/M期阻滯，并能顯著增加細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一結(jié)果與采用Western Blot法和RT—PCR法檢測(cè)到的細(xì)胞周期G1期調(diào)控關(guān)鍵因子cyclin D1的表達(dá)下降以及凋亡相關(guān)因子Bax的表達(dá)水平的下降相一致。 雌激素（estrogen）/雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號(hào)通路的異常激活是乳癌發(fā)生的重要機(jī)制之一，本實(shí)驗(yàn)采

6、用GST捕獲法、免疫共沉淀法等檢測(cè)了Tob1與ER間的相互作用。實(shí)驗(yàn)中采用自行構(gòu)建的一系列可表達(dá)Tob1全長(zhǎng)、各片段缺失體以及“LXXLL”模序突變體的重組表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)行Tob1的功能研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tob1可以和ER發(fā)生相互結(jié)合，而且這種結(jié)合作用與Tob1的氨基末端有關(guān)，但并不完全依賴于LXXLL模序。此外，熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果顯示Tob1可顯著抑制ER的轉(zhuǎn)錄活性。上述結(jié)果共同提示Tob1可能通過(guò)雌激素/ER信號(hào)通路在乳癌的發(fā)生過(guò)程中

7、發(fā)揮重要生物學(xué)作用。 采用相同實(shí)驗(yàn)方法，還檢測(cè)到Tob1不僅與ER信號(hào)通路下游關(guān)鍵調(diào)控因子cyclin D1存在體內(nèi)外相互作用，并能顯著抑制cyclin D1的轉(zhuǎn)錄活性。綜合Tobl對(duì)cyclin D1不同表達(dá)水平的調(diào)控作用，初步闡明了Tob1對(duì)乳癌的細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生影響的具體分子機(jī)制。 最后通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)、TUNEL法、宿主細(xì)胞修復(fù)實(shí)驗(yàn)以及Western Blot法，首次證實(shí)重組腺病毒介導(dǎo)的Tob1高水平表

8、達(dá)可通過(guò)對(duì)受照射細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；外源性Tob1通過(guò)對(duì)DNA損傷修復(fù)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)調(diào)控，抑制受照射細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力；Tob1可能分別通過(guò)上述機(jī)制增加人類乳癌細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性。 總之，本研究首次證實(shí)Tob1可分別通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控以及對(duì)細(xì)胞周期凋亡的誘導(dǎo)發(fā)揮乳癌抑制因子作用，同時(shí)Tob1可通過(guò)對(duì)乳癌細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)的調(diào)控作用而增強(qiáng)乳癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性。這些研究