人VEGF基因修飾大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病后肢缺血研究.pdf

1、目的：利用含人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因的腺病毒表達(dá)載體(Ad-VEGF)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)，采用局部肌肉注射的方法將VEGF基因修飾的BM-MSCs移植到糖尿病大鼠的后肢缺血部位，探討經(jīng)VEGF基因修飾的BM-MSCs移植治療糖尿病后肢缺血的可行性及其應(yīng)用潛力。
　　 方法：(1)大鼠BM-MSCs分離、培養(yǎng)與免疫表型鑒定：無(wú)菌條件下剪取2～3周齡SD大鼠兩側(cè)完整股骨、脛骨，采用D-PBS沖洗骨髓

2、腔，含骨髓細(xì)胞的洗脫液經(jīng)離心后收集細(xì)胞沉淀，用含10％FBS的LG-DMEM，于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行BM-MSCs原代培養(yǎng)，每2 d換液1次，同時(shí)洗脫未貼壁的血細(xì)胞；當(dāng)BM-MSCs生長(zhǎng)匯合度達(dá)60％～80％時(shí)，按2～5×105/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第3代BM-MSCs進(jìn)行CD45、CD29和CD90免疫表型分子分析，并對(duì)其進(jìn)行BrdU體外標(biāo)記。(2)Ad-VEGF腺病毒載體擴(kuò)增與效價(jià)分析：用含10

3、％FBS的HG-DMEM，于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)50％～80％時(shí)，采用直接轉(zhuǎn)染法將Ad-VEGF加入到HEK293細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，置-80℃和37℃反復(fù)凍融3次，離心收集病毒上清后按10倍梯度稀釋，將病毒液加入到接種密度為1×104/孔的HEK293細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，18 h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒效價(jià)。(3)Ad-VEGF轉(zhuǎn)染大鼠BM-MSCs：第3代

4、BM-MSCs生長(zhǎng)匯合度達(dá)50％～80％時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入不同濃度Ad-VEGF，用含2％FBS和10 ng/mlbFGF的LG-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡下觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)效率，結(jié)合病毒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以確定理想的感染復(fù)數(shù)(MOI)值。(4)大鼠2型糖尿病后肢缺血模型的制備：采用成年雄性SD大鼠，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后(體重達(dá)380～450 g)，剪尾取血檢測(cè)血脂變化，按30 mg/kg劑量腹腔注射鏈

5、脲佐菌素(STZ)制備2型糖尿病模型；糖尿病大鼠經(jīng)10％水合氯醛(0.33 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，無(wú)菌條件下于腹股溝韌帶下方手術(shù)結(jié)扎、離斷雙側(cè)股動(dòng)脈，并剝離其周?chē)h(yuǎn)端分支血管，制備2型糖尿病后肢缺血模型。(5)模型細(xì)胞移植試驗(yàn)：將建模成功的2型糖尿病后肢缺血大鼠隨機(jī)分為Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs移植組(n=13)，Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MSCs移植組(n=14)和BM-MSCs對(duì)照移植組(n=15)。取第3代BrdU標(biāo)

6、記的上述各組BM-MSCs，用400μL生理鹽水制成單細(xì)胞懸液(含細(xì)胞總數(shù)2×106個(gè))，自股動(dòng)脈離斷處起分10個(gè)點(diǎn)注射入左后肢的股直肌和腓腸肌中；右后肢相同部位注射等量生理鹽水作為對(duì)照。(6)移植效果評(píng)價(jià)：于移植后2 w、6 w、10 w隨機(jī)選取模型大鼠，采用腹主動(dòng)脈穿刺插管，以1 ml/s速度、111KPa壓力注入4 ml30％碘海醇進(jìn)行數(shù)字減影血管造影(DSA)，以顯示雙后肢動(dòng)脈及灌注情況；造影后分別取2型糖尿病模型大鼠及移植大鼠

7、雙側(cè)股直肌和腓腸肌，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚5μm)及HE染色，置光鏡下觀察，分別統(tǒng)計(jì)股直肌和腓腸肌的毛細(xì)血管數(shù)和肌纖維數(shù)，以兩者比值計(jì)算毛細(xì)血管密度；實(shí)驗(yàn)還采用免疫熒光組化技術(shù)，對(duì)BrdU標(biāo)記BM-MSCs移植細(xì)胞的體內(nèi)存活進(jìn)行冰凍切片示蹤分析。
　　 結(jié)果：(1)分離純化的大鼠BM-MSCs具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征，高表達(dá)CD90和CD29，不表達(dá)CD45；BrdU標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)到75％以上。(2)在HEK293細(xì)胞中

8、成功擴(kuò)增獲得的Ad-VEGF病毒效價(jià)為8×108pfu/ml。(3)當(dāng)MOI值為50時(shí)，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染大鼠BM-MSCs效率可達(dá)53％，且不影響細(xì)胞活性；而MOI值高于50時(shí)，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)BM-MSCs細(xì)胞活性抑制明顯。(4)高脂組體重達(dá)404.4±18.41g、血甘油三酯(TG)為1.46±0.29 mmol/L、總膽固醇(TC)為2.39±0.39 mmol/L，均較普食組顯著增高(P<0.05)；高脂組STZ注射前及注

9、射后1 d、7 d、14 d的大鼠外周血血糖值分別為5.8±0.60 mmol/L、20.52±4.01 mmol/L、25.63±4.74 mmol/L、24.12±3.35mmol/L，注射STZ后的血糖檢測(cè)值均高于16.7 mmol/L的糖尿病制模標(biāo)準(zhǔn)；上述體重、血脂、血糖增高程度符合2型糖尿病病理生理特征。模型大鼠雙后肢結(jié)扎剝離股動(dòng)脈及其分支后，后肢骨骼肌急性缺血并呈暗紫色。(5)DSA結(jié)果顯示，模型大鼠股動(dòng)脈在腹股溝韌帶處中斷

10、，各組移植細(xì)胞2 w、6 w、10 w后雙后肢均可見(jiàn)血管顯影，且血管數(shù)隨時(shí)間推移漸豐富，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs組大鼠左、右側(cè)后肢血管均較BM-MSCs組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MSCs組明顯豐富，但各組大鼠自身左側(cè)血管較右側(cè)增多不明顯。(6)HE染色肌肉組織切片毛細(xì)血管密度分析顯示，移植2 w、6 w、10 w后，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs組雙側(cè)股直肌和腓腸肌的毛細(xì)血管密度均較BM-MSCs組和Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MS

11、Cs組對(duì)應(yīng)肌肉豐富(P<0.05)。移植2 w時(shí)，各組左側(cè)股直肌與腓腸肌的毛細(xì)血管密度均高于其右側(cè)的股直肌和腓腸肌(P<0.05)；移植6 w時(shí)，BM-MSCs組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MSCs組左側(cè)腓腸肌的毛細(xì)血管密度高于其右側(cè)，而Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs組左側(cè)股直肌和腓腸肌的毛細(xì)血管密度均高于右側(cè)，且該組這一特征延續(xù)到移植后10 w(P<0.05)。(7)雙熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，移植后2 w，各組左側(cè)股直肌肌纖維間見(jiàn)BrdU標(biāo)記