人VEGF基因修飾大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病后肢缺血研究.pdf

1、目的：利用含人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的腺病毒表達載體(Ad-VEGF)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)，采用局部肌肉注射的方法將VEGF基因修飾的BM-MSCs移植到糖尿病大鼠的后肢缺血部位，探討經(jīng)VEGF基因修飾的BM-MSCs移植治療糖尿病后肢缺血的可行性及其應(yīng)用潛力。
　　 方法：(1)大鼠BM-MSCs分離、培養(yǎng)與免疫表型鑒定：無菌條件下剪取2～3周齡SD大鼠兩側(cè)完整股骨、脛骨，采用D-PBS沖洗骨髓

2、腔，含骨髓細胞的洗脫液經(jīng)離心后收集細胞沉淀，用含10％FBS的LG-DMEM，于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下進行BM-MSCs原代培養(yǎng)，每2 d換液1次，同時洗脫未貼壁的血細胞；當(dāng)BM-MSCs生長匯合度達60％～80％時，按2～5×105/ml細胞密度進行傳代培養(yǎng)。采用流式細胞術(shù)對第3代BM-MSCs進行CD45、CD29和CD90免疫表型分子分析，并對其進行BrdU體外標記。(2)Ad-VEGF腺病毒載體擴增與效價分析：用含10

3、％FBS的HG-DMEM，于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞生長匯合度達50％～80％時，采用直接轉(zhuǎn)染法將Ad-VEGF加入到HEK293細胞中，48 h后收集細胞，置-80℃和37℃反復(fù)凍融3次，離心收集病毒上清后按10倍梯度稀釋，將病毒液加入到接種密度為1×104/孔的HEK293細胞96孔培養(yǎng)板中，18 h后在熒光顯微鏡下進行熒光細胞計數(shù)，計算病毒效價。(3)Ad-VEGF轉(zhuǎn)染大鼠BM-MSCs：第3代

4、BM-MSCs生長匯合度達50％～80％時，棄培養(yǎng)基，加入不同濃度Ad-VEGF，用含2％FBS和10 ng/mlbFGF的LG-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡下觀察，流式細胞儀檢測GFP表達效率，結(jié)合病毒對細胞生長的影響，以確定理想的感染復(fù)數(shù)(MOI)值。(4)大鼠2型糖尿病后肢缺血模型的制備：采用成年雄性SD大鼠，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)1個月后(體重達380～450 g)，剪尾取血檢測血脂變化，按30 mg/kg劑量腹腔注射鏈

5、脲佐菌素(STZ)制備2型糖尿病模型；糖尿病大鼠經(jīng)10％水合氯醛(0.33 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，無菌條件下于腹股溝韌帶下方手術(shù)結(jié)扎、離斷雙側(cè)股動脈，并剝離其周圍遠端分支血管，制備2型糖尿病后肢缺血模型。(5)模型細胞移植試驗：將建模成功的2型糖尿病后肢缺血大鼠隨機分為Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs移植組(n=13)，Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MSCs移植組(n=14)和BM-MSCs對照移植組(n=15)。取第3代BrdU標

6、記的上述各組BM-MSCs，用400μL生理鹽水制成單細胞懸液(含細胞總數(shù)2×106個)，自股動脈離斷處起分10個點注射入左后肢的股直肌和腓腸肌中；右后肢相同部位注射等量生理鹽水作為對照。(6)移植效果評價：于移植后2 w、6 w、10 w隨機選取模型大鼠，采用腹主動脈穿刺插管，以1 ml/s速度、111KPa壓力注入4 ml30％碘海醇進行數(shù)字減影血管造影(DSA)，以顯示雙后肢動脈及灌注情況；造影后分別取2型糖尿病模型大鼠及移植大鼠

7、雙側(cè)股直肌和腓腸肌，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚5μm)及HE染色，置光鏡下觀察，分別統(tǒng)計股直肌和腓腸肌的毛細血管數(shù)和肌纖維數(shù)，以兩者比值計算毛細血管密度；實驗還采用免疫熒光組化技術(shù)，對BrdU標記BM-MSCs移植細胞的體內(nèi)存活進行冰凍切片示蹤分析。
　　 結(jié)果：(1)分離純化的大鼠BM-MSCs具有典型的間充質(zhì)干細胞表型特征，高表達CD90和CD29，不表達CD45；BrdU標記細胞陽性率達到75％以上。(2)在HEK293細胞中

8、成功擴增獲得的Ad-VEGF病毒效價為8×108pfu/ml。(3)當(dāng)MOI值為50時，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染大鼠BM-MSCs效率可達53％，且不影響細胞活性；而MOI值高于50時，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染對BM-MSCs細胞活性抑制明顯。(4)高脂組體重達404.4±18.41g、血甘油三酯(TG)為1.46±0.29 mmol/L、總膽固醇(TC)為2.39±0.39 mmol/L，均較普食組顯著增高(P<0.05)；高脂組STZ注射前及注

9、射后1 d、7 d、14 d的大鼠外周血血糖值分別為5.8±0.60 mmol/L、20.52±4.01 mmol/L、25.63±4.74 mmol/L、24.12±3.35mmol/L，注射STZ后的血糖檢測值均高于16.7 mmol/L的糖尿病制模標準；上述體重、血脂、血糖增高程度符合2型糖尿病病理生理特征。模型大鼠雙后肢結(jié)扎剝離股動脈及其分支后，后肢骨骼肌急性缺血并呈暗紫色。(5)DSA結(jié)果顯示，模型大鼠股動脈在腹股溝韌帶處中斷

10、，各組移植細胞2 w、6 w、10 w后雙后肢均可見血管顯影，且血管數(shù)隨時間推移漸豐富，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs組大鼠左、右側(cè)后肢血管均較BM-MSCs組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MSCs組明顯豐富，但各組大鼠自身左側(cè)血管較右側(cè)增多不明顯。(6)HE染色肌肉組織切片毛細血管密度分析顯示，移植2 w、6 w、10 w后，Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs組雙側(cè)股直肌和腓腸肌的毛細血管密度均較BM-MSCs組和Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MS

11、Cs組對應(yīng)肌肉豐富(P<0.05)。移植2 w時，各組左側(cè)股直肌與腓腸肌的毛細血管密度均高于其右側(cè)的股直肌和腓腸肌(P<0.05)；移植6 w時，BM-MSCs組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染BM-MSCs組左側(cè)腓腸肌的毛細血管密度高于其右側(cè)，而Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs組左側(cè)股直肌和腓腸肌的毛細血管密度均高于右側(cè)，且該組這一特征延續(xù)到移植后10 w(P<0.05)。(7)雙熒光標記結(jié)果顯示，移植后2 w，各組左側(cè)股直肌肌纖維間見BrdU標記