抑癌基因PTEN抑制人氣道平滑肌細胞的遷移.pdf

1、研究背景及目的: 支氣管哮喘（Bronchial asthma，asthma）是一種以氣道重塑、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性為表現(xiàn)的氣道慢性炎癥性疾病，許多哮喘患者的氣管中除有炎性細胞浸潤外，還存在不同程度的氣管壁結(jié)構(gòu)改變，包括主要有上皮的脫落和增生、杯狀細胞和腺體增生、上皮下膠原和細胞外基質(zhì)沉積、平滑肌肥大和增殖、血管形成、氣道軟骨減少，即氣道重塑（Airway remodeling）。炎癥介質(zhì)及炎癥細胞對氣管反復(fù)損傷和機體對損傷性

2、刺激的修復(fù)性反應(yīng)所形成的氣管新組織結(jié)構(gòu)，而氣道平滑肌細胞（Airway smooth muscle cells，ASMCs）作為氣道中數(shù)目和體積均為最大的細胞，在哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要的作用，被認為是哮喘氣道重塑的關(guān)鍵細胞。ASMCs的收縮、增殖、肥大、分泌細胞外基質(zhì)蛋白等促進氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，并進一步加重氣道高反應(yīng)性（Airway Hyperreactivity，AHR）。 近年來國內(nèi)外的大量研究發(fā)現(xiàn)，ASMCs也具有遷移的

3、功能，這種遷移與動脈粥樣硬化時血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的遷移相類似，因此我們推理：哮喘時ASMCs在細胞外基質(zhì)和各種細胞因子、炎癥介質(zhì)和生長因子的聯(lián)合作用下，ASMCs向氣道內(nèi)膜定向移動并發(fā)生增殖，導(dǎo)致氣道壁的增厚和狹窄，雖然目前還缺乏ASMCs向氣道內(nèi)膜直接遷移的證據(jù)，但有研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者氣道活檢組織標(biāo)本中，氣道固有層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌纖維母細胞在顯微結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)和位置方面都與

4、ASMCs極其相似，提示肌纖維母細胞可能是ASMCs遷移并轉(zhuǎn)化而來，ASMCs的遷移的研究是近來的熱點之一，但對于ASMCs遷移的機制目前還不十分清楚。 而以上這些通路同時也是介導(dǎo)人ASMCs增殖、遷移等的主要信號傳導(dǎo)通路，在人ASMCs中PTEN對這些通路是否也有類似地影響，目前我們尚不清楚。因此，本實驗主要對以下兩個方面進行研究：一）構(gòu)建攜帶野生型質(zhì)粒PTEN的腺病毒載體。二）初步探討PTEN在ASMCs遷移中的作用。

5、 材料與方法: 1、經(jīng)患者同意，取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉、段支氣管標(biāo)本。 2、組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細胞（Airway smooth muscle cells，ASMCs），光鏡下觀察和α-actin細胞免疫組化進行ASMCs鑒定。 3、構(gòu)建攜帶野生型質(zhì)粒PTEN的腺病毒載體，PCR、western blot等鑒定載體構(gòu)建的成功。 3、使用Transwell趨化小室檢測AS

6、MCs的跨膜遷移能力的變化。 4、利用細胞劃痕實驗再次檢測ASMCs遷移能力的變化。 5、FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-肌動蛋白骨架，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察ASMCs細胞骨架的變化。 6、Western blot檢測各組（Ad-PTEN組、Ad-GFP組、DMEM空白對照組）信號通路中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）及黏著斑激酶（FAK）磷酸化水平的改變，以反應(yīng)相應(yīng)信號通路在細胞遷

7、移中的作用。 7、采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行結(jié)果分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，各處理組間比較用析因分析，P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、ASMCs的形態(tài)及免疫組化鑒定：倒置顯微鏡下單個ASMCs呈長梭形，貼壁生長至融合后，細胞呈現(xiàn)出特征的“峰、谷”狀形態(tài)。細胞免疫組化平滑肌細胞表型標(biāo)志物α-actin鑒定，光鏡下可見細胞漿中較多棕黃色顆粒為染色陽性細胞。 2、重組穿梭載體

8、質(zhì)粒、重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過PCR酶切鑒定，得到我們所需的一條1．3 kb小片斷及酶切條帶，腺病毒經(jīng)過包裝、擴增及滴度測定，最終用PTEN的原始質(zhì)粒特異性引物進行PCR，從病毒液中擴增出目的片段，大小為559 bp，因此證實腺病毒構(gòu)建成功。 3、體外細胞劃痕實驗可見在0 h時，Ad-PTEN、Ad-GFP與DMEM三組之間劃痕面積（細胞數(shù)）相差不大，三組作用于ASMC48 h后，加入刺激因子PDGF-BB組：Ad-PTEN（44．4

9、±9．15）細胞數(shù)明顯較Ad-GFP（215．20±27．02）與DMEM（192．80±19．89）明星減少，而未加入刺激因子PDGF-BB組：Ad-PTEN（38．40±7．73）、Ad-GFP（94．40±12．05）、DMEM（83．20±7．59）。在Ad-PTEN組細胞遷移數(shù)目的減少與腺病毒本身無關(guān)，而是目的基因PTEN起到抑制細胞遷移的作用（P<0．00），因為空病毒對照組Ad-GFP與無病毒對照組DMEM間細胞遷移的面積

10、相差不大（P>0．163）。同時經(jīng)過PDGF-BB處理的三組ASMCs遷移的細胞數(shù)目較未加PDGF-BB處理明顯增加。 4、Transwell趨化小室檢測法證實腺病毒Ad-PTEN明顯能抑制ASMCs的遷移活動，Ad-PTEN作用于ASMCs時遷移細胞數(shù)目是（206．40±20．48），而Ad-GFP組與DMEM空白對照組細胞遷移的數(shù)目分別是（658．00±46．58）、（658．80±61．81），而加入刺激因子PDGF-BB

11、后各組的細胞遷移數(shù)目分別是：Ad-PTEN（610．40±26．20）、Ad-GFP（1506．60±92．03）、DMEM（1511．20±71．66），這較不加刺激因子組有較大的促進遷移作用，無論是否存在刺激因子，Ad-PTEN較Ad-GFP及DMEM相比，有明顯的差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．00）。說明PTEN能抑制ASMCs的遷移活動，同時再次驗證PDGF-BB是一個促遷移因子。 5、激光共聚焦觀察細胞骨架：Ad-G

12、FP、DMEM空白對照組細胞有少量短而細的應(yīng)力纖維，很少絲狀偽足形成，而Ad-PTEN可見細胞細胞輪廓變細，偽足及應(yīng)力纖維明顯變少。Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組加入刺激因子PDGF-BB刺激60min后，細胞即發(fā)生伸展，應(yīng)力纖維形成增多。 6、Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM處理后：（1）、磷酸化Akt（p-Akt）/總的Akt灰度值比分別為：0．059±0．001、0．503±0．001、0．502±0．0

13、01，三組間有顯著性差異（P<0．00），有統(tǒng)計學(xué)意義，說明PTEN可能通過抑制Akt通路抑制ASMCs的遷移，Ad-PTEN組p-Akt表達水平顯著減少，而兩對照組間無顯著性差異（P>0．244）。而加入刺激因子PDGF-BB后，Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組磷酸化Akt（p-Akt）/總的Akt灰度值比分別為：0．098±0．001、0．701±0．001、0．700±0．001，與未加刺激組同理，亦有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）

14、、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）/總的ERK1/2灰度值比分別為：0．745±0．002、0．743±0．002、0．744±0．002，三組間無顯著性差異（P>0．15），無統(tǒng)計學(xué)意義，PTEN可能不是通過抑制ERK1/2通路而抑制氣道平滑肌細胞的遷移。而加入刺激因子PDGF-BB后，Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）/總的ERK1/2灰度值比分別為：0．802±0．001、0．8

15、03±0．001、0．804±0．002，同理亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．071）。（3）、磷酸化FAK（p-FAK）/總的FAK灰度值比分別為：0．099±0．002、0．647±0．001、0．649±0．001，三組間有顯著性差異（P<0．00），有統(tǒng)計學(xué)意義，說明PTEN可能通過抑制FAK通路抑制ASMCs的遷移，Ad-PTEN組p-FAK表達水平顯著減少，而兩對照組間無顯著性差異（P>0．767）。而加入刺激因子PDGF-BB后，

16、Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組磷酸化FAK（p-FAK）/總的FAK灰度值比分別為：0．081±0．040、0．721±0．001、0．725±0．001。與未加刺激組同理，亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．00）。 結(jié)論: PTEN能夠通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）及黏著斑激酶（FAK）等信號通路從而抑制ASMCs的遷移，且PTEN可能通過抑制細胞骨架蛋白的改變來抑制ASMCs的遷移，這提示PTEN對氣道