ERK1和ERK2在IL-1β介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)理中的研究.pdf

1、目的：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarhritis OA)是最常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)疾病。由于OA的確切病因和病理機(jī)制尚不太清楚，目前缺乏理想的藥物治療，探討OA的治療靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，白介素1-β(Interleukin-1β IL-1β)是關(guān)節(jié)軟骨退變病理過(guò)程中最主要的炎癥細(xì)胞因子之一。IL-1β可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表達(dá)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenas-2 COX-2)和分泌前列腺素E2(prostaglandin E2 PGE

2、2)等炎癥介質(zhì)參與OA的炎癥病理過(guò)程。此外，IL-1β可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表達(dá)金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)降解軟骨基質(zhì)成分，并抑制Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表達(dá)而抑制軟骨基質(zhì)的合成，從而加速OA的軟骨基質(zhì)降解的病理過(guò)程。研究表明ERK1/2是IL-1β介導(dǎo)OA的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。ERK1和ERK2是ERK1/2的2個(gè)亞型。ERK1和ERK2在

3、IL-1β介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)COX-2、MMP3、MMP13、typeⅡ collagen和Aggrecan及分泌PGE2中各自扮演的角色目前尚不清楚；而且，ERK1和ERK2在此過(guò)程的相互關(guān)系也未明確。因此，探討ERK1和ERK2在此過(guò)程的各自扮演的角色及它們之間的相互關(guān)系，對(duì)了解ERK1和ERK2在IL-1β介導(dǎo)的OA中的作用有重要意義，為OA的治療靶點(diǎn)的選擇提供理論依據(jù)。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞并進(jìn)行Ⅱ型膠

4、原蛋白免疫組化和甲苯胺蘭染色鑒定。針對(duì)人ERK1和ERK2基因分別設(shè)計(jì)3條siRNA序列，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體并進(jìn)行慢病毒包裝。通過(guò)real-time PCR和western blotting篩選出最有效的siRNA序列。用IL-1β刺激人軟骨細(xì)胞，24小時(shí)后，real-time PCR、western blotting和ELISA檢測(cè)COX-2、MMP3、MMP13、typeⅡ collagen、Aggrecan、pERK1/2和ERK

5、1/2的基因表達(dá)和/或蛋白水平和PGE2的分泌。用慢病毒介導(dǎo)最有效的ERK1和ERK2 siRNA同時(shí)或分別轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞。用IL-1β刺激被轉(zhuǎn)染的人軟骨細(xì)胞，24小時(shí)后，real-time PCR、western blotting和ELISA檢測(cè)COX-2、MMP3、MMP13、typeⅡ collagen、Aggrecan、pERK1/2和ERK1/2的基因表達(dá)和/或蛋白水平和PGE2的分泌。
　　 結(jié)果：第一代人軟骨細(xì)胞Ⅱ

6、型膠原蛋白表達(dá)較強(qiáng)。第一代人軟骨細(xì)胞甲苯胺蘭染色細(xì)胞呈紫藍(lán)色。結(jié)果表明傳代后的第一代人軟骨細(xì)胞維持著良好的軟骨細(xì)胞表型。real-time PCR和western blotting顯示ERK1 siRNA1、2、3和ERK2 siRNA1、2、3均能分別特異性沉默ERK1和ERK2，ERK1 siRNA3和ERK2 siRNA2分別為ERK1和ERK2最有效的干擾序列。IL-1β誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞表達(dá)COX-2、MMP3、MMP13并促進(jìn)P

7、GE2分泌，抑制typeⅡ Collegan和Aggrecan的表達(dá)，同時(shí)ERK1/2被激活。分別沉默ERK1或ERK2時(shí)均能充分抑制IL-1β誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞表達(dá)COX-2、MMP3、MMP13和分泌PGE2，逆轉(zhuǎn)IL-1β抑制typeⅡ Collegan和Aggrecan的表達(dá)，并相應(yīng)降低pERK1/ERK1或pERK2/ERK2蛋白水平。同時(shí)沉默ERK1和ERK2有協(xié)同效應(yīng)，伴pERK1/2和ERK1/2蛋白水平降低。