膿毒癥早期大鼠腎上腺TLR4、TNF-αmRNA表達(dá)、超微結(jié)構(gòu)變化及地塞米松干預(yù)影響.pdf

1、目的：膿毒癥合并相對腎上腺皮質(zhì)功能不全與多器官功能障礙綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，顯著增加膿毒癥患者的病死率。Marik報(bào)道危重患者相對腎上腺皮質(zhì)功能不全(relativeadrenal insufficiency，RAI)的總體發(fā)病率為30％～40％，膿毒癥休克患者可高達(dá)60％，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。為此，早期識別及積極干預(yù)膿毒癥及膿毒癥休克合并RAI患者，對改善預(yù)后意義重大。但是，目前膿毒癥合并RAI的發(fā)病機(jī)制尚不很清楚，伴隨腎上腺皮質(zhì)功能

2、不全的發(fā)生是否存在相應(yīng)的組織形態(tài)學(xué)改變，國內(nèi)外尚無明確報(bào)道。小劑量糖皮質(zhì)激素能顯著降低膿毒癥休克合并急性腎上腺皮質(zhì)功能不全患者的病死率，改善預(yù)后。但目前糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的時機(jī)、劑量、具體療程均存在爭議。本實(shí)驗(yàn)通過觀察膿毒癥早期大鼠的血清皮質(zhì)醇濃度、腎上腺組織Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA的表達(dá)、組織微觀結(jié)構(gòu)變化以及不同時間應(yīng)用小劑量地塞米松對其干預(yù)的影響，判別膿毒癥早期是否存在相對腎上腺皮質(zhì)功能不全，并

3、探討其可能的發(fā)病機(jī)制，以及地塞米松替代治療的時機(jī)，以期為臨床積極治療膿毒癥及膿毒癥休克，降低病死率提供有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：膿毒癥動物模型采用盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal liga-tion and puncture，CLP)復(fù)制，小劑量促腎上腺皮質(zhì)激素(ad-renocor-ticotropic hormone，ACTH)刺激試驗(yàn)判斷膿毒癥早期大鼠腎上腺皮質(zhì)的功能狀態(tài)，以ACTH刺激前后血清皮質(zhì)醇濃度無顯著差異，定義為RAI。

4、實(shí)驗(yàn)動物選擇健康雄性清潔級Wistar大鼠260只(607123)，體重250～300g，隨機(jī)分為5組：(1)正常對照組(n=50)；(2)假手術(shù)組(n=50)：僅打開腹腔，不做CLP；(3)模型組(n=50)：僅做CLP；(4)地塞米松預(yù)先給藥組(n=50)：CLP術(shù)前腹腔注射地塞米10mg.kg-1；(5)地塞米松治療組(n=50)：CLP術(shù)后7h腹腔注射地塞米松10mg.kg-1。各組均分2h、4h、6h、8h、12h五個時間點(diǎn)，

5、每個時間點(diǎn)10只大鼠。每組按時間點(diǎn)留取腎上腺，液氮保存做半定量RT-PCR檢測TLR4、TNF-αmRNA的表達(dá)。各組8h、12h時間點(diǎn)動物做ACTH刺激試驗(yàn)，均于術(shù)后(CLP/單純開腹術(shù))6h腹腔注射ACTH 0.8μg.kg-1，于注射前、后30min經(jīng)頸總動脈測壓管采血，分別記做T0、T30，留取血清，-70℃凍存，采用液相平衡放射免疫分析法(radioimmunoa-ssay，RIA)測定血清中皮質(zhì)醇濃度。此外，隨機(jī)選取各組大鼠

6、各2只，于CLP/開腹術(shù)后12h行1％多聚甲醛經(jīng)主動脈灌注固定留取腎上腺皮質(zhì)，做電鏡切片。模型組、地塞米松預(yù)先給藥組和治療組動物做12h生存率的統(tǒng)計(jì)(按時間點(diǎn)處死的動物除外)。用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，計(jì)量資料行單因素方差分析及配對t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行多個樣本率比較的X2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.各組ACTH刺激前血清皮質(zhì)醇濃度的比較：

7、模型組(13.84±4.42ng/ml)、地塞米松預(yù)先給藥組(20.83±6.58ng/m1)和地塞米松治療組(12.60±3.07ng/ml)ACTH注射前血清皮質(zhì)醇濃度明顯高于正常對照組(9.80±2.27ng/ml)和假手術(shù)組(8.32±2.09ng/ml)(P<0.05)；而地塞米松預(yù)先給藥組明顯高于模型組和地塞米松治療組(P<0.05)。 2 各組ACTH刺激前、后血清皮質(zhì)醇濃度變化的比較： 正常對照組和假手術(shù)組腹腔注

8、射ACTH后30分鐘血清皮質(zhì)醇濃度(T30)較注射ACTH前(T0)明顯升高(13.91±2.56ng/ml vs 9.80±2.27ng/ml；9.41±2.83ng/ml vs8.10±1.86ng/ml)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；模型組、地塞米松預(yù)先給藥組和地塞米松治療組T30血清皮質(zhì)醇濃度與T0無明顯差異。 3.各組腎上腺組織TLR4、TNF-α mRNA表達(dá)的比較： 模型組TLR4、FNF-α mRNA

9、的表達(dá)均明顯升高，TLR4于4h達(dá)高峰，TNF-α于2h即達(dá)高峰，12h兩者均保持在較高水平。地塞米松預(yù)先給藥組TLR4、TNF-α mRNA的表達(dá)2h均較模型組明顯下降(P<0.05)，但仍顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，4h TLR4、TNF-α mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組沒有差異，12h TLR4、TNF-α mRNA的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；地塞米松治療組TLR4、 TNF-α mRNA于8、12h的表達(dá)較模型組明

10、顯下降，但仍顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。 4.各組腎上腺組織超微結(jié)構(gòu)變化的比較：模型組、地塞米松預(yù)先給藥組和地塞米松治療組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞均出現(xiàn)脂質(zhì)耗減、髓鞘樣小體以及管泡狀嵴的線粒體嵴和膜部分或全部溶解消失的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，其中以模型組為著。 5.各組大鼠12h生存率的比較： 地塞米松預(yù)先給藥組12h生存率(76.92％)明顯高于模型組(33.33％)(P<0.01)和地塞米松治療組(40％)(

11、P<0.05)，地塞米松治療組12h生存率顯著高于模型組(P<0.05)。 結(jié)論： 1.膿毒癥早期即存在相對腎上腺皮質(zhì)功能不全。 2.膿毒癥早期合并RAI大鼠腎上腺組織TLR4、TNF-αmRNA的表達(dá)明顯升高，可能與膿毒癥伴RAI的發(fā)生有關(guān)。 3.膿毒癥早期合并RAI大鼠腎上腺組織TNF-αmRNA的表達(dá)高峰明顯早于TLR4，由此推測，LPS引起炎性因子的釋放可能并不完全依靠TLR4的識別。 4