海水淹溺兔肺泡巨噬細胞TNF-αmRNA的動態(tài)表達及地塞米松干預作用.pdf

1、海水淹溺（Sea water drowning）不僅常發(fā)生于航海事故、海上作業(yè)、海上旅行等，而且是軍隊海上訓練和作戰(zhàn)減員的重要原因[1]。海水淹溺可導致急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴重者可發(fā)展為海水型呼吸窘迫綜合征（sea water respiratory distress syndrome，SW-RDS），病情嚴重，救治極為困難[2]。因此，研究海水型ALI的早期救治，并防止其向SW-RDS轉化，具有重

2、要的意義。有學者報道地塞米松可以減輕海水淹溺后急性肺損傷，但具體機制尚不明確[3-4]。普遍認為TNF-α是導致ALI/ARDS的啟動因子[5-7]，而海水淹溺后TNF-αmRNA的動態(tài)表達及地塞米松對海水淹溺后巨噬細胞內TNF-α分子表達的影響尚未報道。本研究試圖闡明TNF-α在SW-RDS發(fā)病機制中的作用，探索地塞米松對海水型ALI的治療機制。
　　目的：通過向兔氣管內灌注海水，模擬海水淹溺后導致ALI生理過程，在灌注后不同時

3、點觀察AM內TNF-αmRNA的動態(tài)表達，并應用地塞米松（Dexamethasone，Dex）進行干預，探討地塞米松對海水淹溺急性肺損傷的治療作用及相應的機制。
　　方法：
　　1.實驗分組：
　　健康新西蘭大耳兔40只(第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)，體重（2.50±0.36）kg。為觀察海水淹溺后肺泡巨噬細胞（AM）內TNF-αmRNA的動態(tài)表達，25只兔隨機分成5組：海水淹溺后0min（正常對照組）、30、60、

4、90、120min時點組；為了解地塞米松對海水淹溺后AM內TNF-αmRNA表達的影響，15只兔隨機分為3組（每組5只）：①對照組（Control group，C組）：僅作氣管插管，不作其他處理；②海水淹溺組（Model group，M組）：制備動物模型，以等量生理鹽水代替地塞米松靜脈注射。③地塞米松治療組（Treatment group，T組）：模型建立后立即靜脈注射地塞米松2mg/kg，隨即以（1mg·kg-1·h-1）靜脈維持。<

5、br>　　2.建立海水淹溺家兔急性肺損傷模型
　　3．動脈血氣分析各組均于手術或模型建立后0min、30min、60min、90min、120min經左側股內動脈采集0.5ml動脈血注入抗凝試管用于動脈血氣分析，采血0.6ml，血氣分析由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院血氣/肺功能室測定。
　　4．支氣管肺泡灌洗液（BALF）的采集：25只時點組兔于上述各時點放血處死，C組、M組、T組于100分鐘放血處死，隨后開胸、夾閉氣管取全肺。左側

6、肺葉作肺泡灌洗:生理鹽水以5ml/次，共10ml，回收率70％左右。
　　5．肺組織的離體觀察
　　分別于致傷后0min、30min、60min、90min、120min分批處死家兔，取肺組織，觀察肺臟的肉眼變化，并使用數碼相機拍照記錄。肺組織含水量測定:采用干濕重稱重法測定:：取得右肺上、中葉，稱取肺濕重(W)，而后置于100℃恒溫烤箱內48h至重量恒定后稱肺干重(D)，肺含水量=(肺濕重－肺干重)／肺干重。取左肺下葉組織

7、稱重標記，冷凍保存于-70℃環(huán)境。測量腫瘤壞死因子a（TNF-a）、IL-10的含量。各組于右下葉同等部位取0.5g肺組織置于10％福爾馬林溶液中，固定組織塊，經石蠟包埋切片，HE染色后，觀察組織病理學改變。
　　6．肺泡巨噬細胞的分離和培養(yǎng)
　　將支氣管肺泡灌洗液1000r／min離心10min，沉淀用D-Hank液洗滌，以RPMI-1640懸浮后，置25mL玻璃細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％二氧化碳、PH7.2條件下培養(yǎng)4

8、小時，等AM黏附于玻璃表面，再用培養(yǎng)液沖洗掉未黏附的中性粒細胞和淋巴細胞等，分離純化的AM以瑞氏染色證實為巨噬細胞，純度>95％，臺盼藍染色鑒定細胞活力>90％。
　　7．逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測兔肺泡巨噬細胞內TNF-amRNA表達
　　結果：
　　（1）血氣分析結果顯示，PE-SWD模型建立后，60min時，PaO2降低到到最低點(31.6±4.98mmHg，1mmHg=0.133kPa)后逐漸升高，

9、到120分鐘再次降低；PCO2在30min升至最高點，后逐漸回復，可能與家兔代償性過度通氣有關；PH值和D/W在模型建立后進行性下降。
　　(2)病理學檢查結果顯示：大體標本可見海水淹溺后雙肺表面散在暗紅色片狀區(qū)及點狀出血區(qū)，以雙下肺背側為主，呈“紅色肝樣變”，肺組織切面及氣管腔內有中量血性粉紅色泡沫樣液體滲出。以地塞米松治療后的T組亦可見基本相同的肺損傷區(qū)域，但總體顏色較淡。HE染色（×100倍）下，M組可見肺泡及肺間質水腫明顯

10、，肺出血、肺泡隔斷裂，肺泡腔及微血管中大量炎癥細胞（主要為中性粒細胞）浸潤，肺損傷程度嚴重；而T組肺泡擴張、水腫明顯，肺泡腔及間質內炎癥細胞浸潤較輕，肺損傷程度較M組減輕。
　　(3)RT-PCR方法檢測海水淹溺后家兔AM內TNF-αmRNA的表達即開始上升，隨時間增加逐漸增高.90分鐘左右達到高峰，之后輕微下降，但仍明顯高于正常對照組(P<0.01)。C組AM中TNF-αmRNA僅有輕微表達，M組顯著升高（P<0.01）：T組顯

11、著低于M組(P<0.05)。
　　結論：
　　1．本實驗結果表明兔PO2、PH進行性下降，提示肺換氣功能受損嚴重，符合ALI/ARDS診斷標準，表明海水淹溺致急性肺損傷兔模型構建成功。
　　2．SW-RDS家兔肺泡巨噬細胞中TNF-amRNA的表達水平在模型建立后即開始升高（P<0.01），說明SW-RDS原因可能與肺泡巨噬細胞內TNF-αmRNA高表達有關；對SW-RDS動物模型AM中TNF-αmRNA的動態(tài)分析，提