登革病毒2型及其E蛋白與宿主細胞氧化還原狀態(tài)的關(guān)系.pdf

1、登革病毒(denguevirus，DV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，分為四個血清型(DV1～4)。DV主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，每種血清型都可引起人類登革熱(classicaldenguefever，DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome，DHF/DSS)。近年來，隨著旅游業(yè)的發(fā)展和地球溫暖化，DF和DHF/DSS流行、暴發(fā)越來越頻繁。DHF/D

2、SS患者病死率高，發(fā)病機制不清。 較多的臨床研究顯示肝細胞是DV的重要靶細胞之一，肝損害在DHF/DSS發(fā)病過程中占有重要地位： 1)肝組織中可以檢測到DV抗原，并能分離到具有感染性的病毒； 2)DV還可以感染體外培養(yǎng)的HepG2，HuH-7，HA22T，Hep3B，PLC等人類肝癌細胞株，培養(yǎng)上清中也可檢測到成熟的病毒顆粒； 3)DHF/DSS病人常常出現(xiàn)肝腫大，尸檢可見肝組織脂肪變性，枯否氏細胞肥大等

3、。血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，凝血酶含量下降，其幅度變化與肝損害程度及出血、休克的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)文獻報道，DV可以直接感染肝細胞，引起肝臟損傷，換言之，肝臟可能是DV重要的靶器官之一。然而，在過去相當長的時間里，學(xué)者們對DV感染后凝血系統(tǒng)、血管內(nèi)皮細胞及炎癥因子變化做了較多的研究，與之相比，肝細胞損傷機制所受關(guān)注較少，如能發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制對肝細胞哪些方面產(chǎn)生了影響，找到宿主細胞參與病毒復(fù)制的關(guān)鍵分子，不僅對DV感染機制的闡明有重要意義，同時也為進

4、一步研究抗病毒藥物奠定重要的基礎(chǔ)。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1.DV2感染對HepG2細胞內(nèi)外GSH水平的影響 感染組加入DV2以MOI=10感染HepG2細胞，模擬感染組則加入56℃滅活30min的病毒液，同等條件置于37℃，以感染起始記為O時，在感染10min、20min、30min、40min、60min/1h、2h、6h、12h、24h、48h(后5個時相點吸附后1h，更換病毒維持液)時，分別用PBS

5、充分洗滌細胞，胰蛋白酶消化，取出細胞。經(jīng)過四次快速凍融，離心取上清用于GSH的測定。取相同數(shù)量的細胞經(jīng)超聲裂解用于測定細胞蛋白濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染后10min、20min、30min、40min、60min/1h，HepG2細胞內(nèi)GSH水平與模擬感染組比較，呈下降趨勢，其中以30min下降最為明顯，為16.82±0.86nmol/mg(n=5)，與模擬感染組23.14±1.41nmol/mg(n=5)和感染組的其他時相點比較均有顯著

6、差異(P＜0.01)。病毒感染后2h、6h、12h、24h、48h，HepG2細胞內(nèi)GSH水平與模擬感染組比較，仍呈下降趨勢，其中以2h，24h時下降較為明顯，分別為29.51±3.16nmol/mg(n=5)和17.75±3.32nmol/mg(n=5)，與相應(yīng)時相點的模擬感染組35.45±3.55nmol/mg(n=5)和22.91±4.15nmol/mg(n=5)以及感染組的其它時相點比較，差異顯著(P＜0.05)，其后逐漸恢復(fù)，

7、到48h時已與模擬感染組無顯著差異(P＞0.05)。 感染后30min上清中的GSH含量為47.86±3.00nmol/ml(n=4)，較模擬感染組升高33.09％，且有顯著差異(P＜0.05)，而模擬感染組與病毒原液則無顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果說明DV2感染能夠使HepG2細胞內(nèi)GSH水平下降，改變宿主細胞的氧化還原狀態(tài)，且呈現(xiàn)階段性變化，推測可能與病毒的復(fù)制過程有關(guān)。結(jié)合感染后同一時相點細胞外GSH水平的升高和文獻

8、報道，推測DV2感染后30min細胞內(nèi)GSH水平的快速降低可能是由于DV2感染所致細胞膜通透性增加、GSH的外漏引起的。 2.DV2E蛋白對宿主細胞內(nèi)外GSH水平的影響 首先構(gòu)建了穩(wěn)定表達E蛋白的HepG2細胞株pRe-E/HepG2，并且通過PCR、酶切、核苷酸測序及間接免疫熒光法進行了鑒定和檢測，確認了該細胞中E蛋白的表達。同時構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞株pRe-E/HepG2作為對照。 然后測定了pRe-E

9、/HepG2細胞內(nèi)外GSH的水平。結(jié)果：pRe-E/HepG2細胞內(nèi)GSH水平與pRe/HepG2細胞對照組比較，呈下降趨勢。pRe-E/HepG2細胞內(nèi)GSH平均濃度為25.61±2.23nmol/mg(n=4)，pRe/HepG2細胞內(nèi)的GSH平均濃度為33.38±1.07nmol/mg(n=4)，與pRe/HepG2細胞比較，pRe.E/HepG2細胞內(nèi)GSH下降了24.3％(P＜0.01)。取對數(shù)生長期pRe-E/HepG2和p

10、Re/HepG2細胞的培養(yǎng)上清0.5ml測定GSH濃度，發(fā)現(xiàn)pRe-E/HepG2細胞上清中GSH含量平均值為36.72±1.40nmol/ml(n4)，pRe/HepG2細胞上清中GSH含量平均為57.41±2.00nmol/ml(n=4)，前者相較后者明顯降低，兩者差異顯著(P＜0.05)，前者較后者平均下降了36.35％。以上結(jié)果表明，穩(wěn)定表達E蛋白的pRe-E/HepG2細胞較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的pRe/HepG2細胞，細胞內(nèi)外GS

11、H濃度均下降顯著，提示E蛋白在宿主細胞中的表達不僅可以改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，還可以使宿主細胞外的GSH水平降低，在DV2感染誘使的細胞氧化還原狀態(tài)變化的過程中，E蛋白可能起重要作用。 3.BSO及外源性GSH處理對DV2感染的影響 依據(jù)MTT實驗結(jié)果并參照文獻，選擇BSO的處理濃度為0.2mM和1mM，外源性GSH的處理濃度為10mM和20mM。 在不感染病毒的情況下，培養(yǎng)上清中加入0.2mM、1mMBSO處

12、理18h，可使細胞內(nèi)GSH含量由空白對照組的24.53±2.59nmol/mg(n=5)分別下降至14.29±1.48nmol/mg(n=5)、14.05±1.93nmol/mg(n=5)(P＜0.05)，且兩種濃度下降幅度無顯著差異(P＞0.05)，幅度平均為42.24％(n=5)。在DV2感染+BSO處理組，感染前18h分別用0.2mM、1mMBSO預(yù)處理HepG2細胞，然后用DV2以MoI=1感染HepG2細胞，并維持BSO濃度至

13、感染24h，空白對照組不加藥物處理。感染后24h收取病毒上清，噬斑試驗測定病毒滴度(PFU/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2mM與1mMBSO處理組病毒滴度較空白對照組分別上升了119.79％(n=5)和127.51％(n=5)，與空白對照組比較差別顯著(P＜0.05)，但兩種濃度BSO處理組的病毒滴度上升幅度無顯著差異(P＞0.05)。 在不感染病毒的情況下，培養(yǎng)上清中加入10mM、20mMGSH溶液與空白對照組相比，細胞內(nèi)GSH含量均

14、無顯著差異(P＞0.05)；在DV2感染+GSH處理組，從感染起始到感染24h維持上清內(nèi)GSH濃度分別為10mM、20mM，空白對照組不加藥物處理。感染后24h收取病毒上清，測定病毒滴度(PFU/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)較空白對照組而言，10mM與20mMGSH處理組病毒滴度分別下降40.24％(n=5)和56.62％(n=5)，兩種濃度GSH處理組均與空白對照組差異顯著(P＜0.05)，且20mMGSH處理組病毒滴度下降更為明顯(P＜0.05