登革病毒EDIII蛋白的表達(dá)、純化及其與ECV304細(xì)胞相互作用蛋白的篩選與鑒定研究.pdf

1、登革病毒(dengue virus，DENV)是黃病毒屬(Flaviviridae)有包膜的單股正鏈RNA病毒，有四個(gè)血清型(DENV-1～4)，以蚊蟲為媒介，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。DENV感染所致的人類登革熱(classical dengue fever，DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS)嚴(yán)重危害人類健康。全球有25～3

2、0億人生活在流行區(qū)內(nèi)，每年有1億以上的人遭受感染，DHF病例約50萬，死亡率5～20%，如治療不及時(shí)可達(dá)50%。近年來，隨著全球氣候變暖、人口流動、生態(tài)環(huán)境惡化、蚊媒分布區(qū)域擴(kuò)展等諸多原因，登革熱流行的范圍和頻率不斷增加，WHO已將DHF/DSS、肝炎、瘧疾、結(jié)核列為全球流行最嚴(yán)重的傳染病。我國海南、廣東、廣西、福建、浙江和臺灣等地區(qū)也都是重點(diǎn)流行區(qū)域，多次發(fā)生DF，DHF/DSS的爆發(fā)流行。但時(shí)至今日，對DENV感染性疾病尚無特異的治

3、療手段，也無安全有效的疫苗問世。因此，對DENV的致病機(jī)理展開深入研究，并從中發(fā)掘有效的治療策略和途徑是當(dāng)前病毒學(xué)研究的當(dāng)務(wù)之急。
　　 DENV經(jīng)蚊蟲叮咬進(jìn)入人體后，先在單核細(xì)胞系統(tǒng)(如樹突狀細(xì)胞，單核細(xì)胞等)和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)等靶細(xì)胞中增殖，經(jīng)血流播散，引起疾病。血中高滴度的病毒可累及全身毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起廣泛微血管內(nèi)皮功能障礙，血管通透性增加、出血和休克

4、，介導(dǎo)DHF/DSS的發(fā)生。所以，人血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上必然存在著介導(dǎo)DENV感染的受體，但該受體迄今尚未闡明。因此，鑒定出血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的DENV受體，對研究DENV的致病機(jī)理、研發(fā)受體特異性阻斷劑等均具有非常重要的意義。
　　 DENV受體的研究很早就受到重視，研究的方法也有很多，其中病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(Virus overlay protein binding assay，VOPBA)是較為“經(jīng)典”的一種病毒受體篩選技術(shù)，

5、該方法是以Western blot為基礎(chǔ)，將細(xì)胞膜蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上與病毒顆粒進(jìn)行孵育，利用病毒顆粒與受體蛋白特異性結(jié)合的特點(diǎn)，分離病毒受體。VOPBA方法在鑒別病毒受體中雖應(yīng)用廣泛，但也有一定的局限性，如由于與轉(zhuǎn)印膜孵育的是完整病毒顆粒，個(gè)頭相對較大，與轉(zhuǎn)印膜上的潛在受體蛋白結(jié)合不穩(wěn)定，易造成漏篩，所以如果利用DENV與受體結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域--包膜E蛋白DⅢ區(qū)代替完整病毒顆粒進(jìn)行VOPBA將更有助于病毒受體的篩選。
　　

6、本研究首先采用原核表達(dá)并純化了DENV-2 E蛋白DⅢ區(qū)(EDⅢ)蛋白，用于代替全病毒顆粒建立改良的VOPBA技術(shù)，并以人血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的ECV304細(xì)胞系為靶細(xì)胞進(jìn)行DENV相互作用蛋白的篩選工作，對篩選到的候選蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、Westernblot實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證篩選蛋白，再通過免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦顯微技術(shù)明確篩選蛋白與DENV-2 EDⅢ[蛋白的相互關(guān)系及與病毒的共定位情況；最后，用生物信息學(xué)的方法模擬篩選

7、蛋白與DENV-2 EDⅢ蛋白可能的結(jié)合方式和參與結(jié)合的殘基，探討篩選蛋白在DENV-2感染宿主細(xì)胞過程中的作用，為進(jìn)一步揭示DENV的感染機(jī)制、研發(fā)受體特異性阻斷劑奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 其研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面：
　　 1.DENV-2 EDⅢ蛋白的原核表達(dá)、純化及其抗體制備：①利用PCR從pV-DENV2-E質(zhì)粒上擴(kuò)增出EDⅢ基因；②通過酶切連接將EDⅢ基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET22b+中，轉(zhuǎn)化入大

8、腸桿菌Rosetta(DE3)plysS；③對pET22b-EDⅢ/Rosetta工程菌進(jìn)行表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行摸索，獲得的工程菌表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后，EDⅢ蛋白質(zhì)以包涵體的形式存在；④pET22b-EDⅢ/Rosetta工程菌表達(dá)得到的目的蛋白包涵體，經(jīng)Ni-NTA親和層析和陽離子交換層析兩步純化后，獲得純度達(dá)98%以上的目標(biāo)蛋白，并對蛋白進(jìn)行Western blot鑒定；⑤將純化好的目的蛋白經(jīng)透析法復(fù)性，并采用改良Lowry法進(jìn)行

9、蛋白質(zhì)定量后，凍存?zhèn)溆茫虎逓楂@得目的蛋白抗體，將目的蛋白分別免疫Balb/c和C57BL/6小鼠，得到相應(yīng)抗體后加等體積甘油凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2.改良VOPBA方法篩選ECV304細(xì)胞上DENV相互作用蛋白：①利用差速離心的方法提取人血管內(nèi)皮ECV304細(xì)胞各組分蛋白；②用純化的DENV-2 EDⅢ蛋白代替全病毒顆粒，建立了改良的VOPBA技術(shù)，并成功在ECV304細(xì)胞膜蛋白提取物中篩選到34，43和55 kDa三個(gè)蛋白能與ED

10、Ⅲ蛋白相互作用，質(zhì)譜分析顯示篩選到的43 kDa蛋白為微絲(fibrous-actin，F(xiàn)-actin)，55 kDa蛋白為波形蛋白(vimentin)；③制備43 kDa蛋白小鼠抗血清進(jìn)行阻斷改良VOPBA實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)選到的43kDa蛋白為actin；④利用Co-IP實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證actin與DENV-2 EDⅢ蛋白相互作用，提示DENV可能是通過包膜E蛋白Ⅲ區(qū)這樣功能結(jié)構(gòu)域結(jié)合actin的。
　

11、　 3.43 kDa actin蛋白在DENV感染過程中的作用：①激光共聚焦顯微技術(shù)觀察DENV-2感染不同時(shí)相點(diǎn)的人血管內(nèi)皮ECV304細(xì)胞中微絲骨架的形態(tài)變化，感染第5min時(shí)，細(xì)胞微絲出現(xiàn)了解聚，較多的短F-actin積聚形成團(tuán)塊，從感染的第35 mim～1h，部分應(yīng)力纖維束開始恢復(fù)，主要分布在細(xì)胞膜下的皮質(zhì)區(qū)，感染24 h后，由于病毒的大量復(fù)制、病毒蛋白的堆積，又能再次引起F-actin的解聚以及應(yīng)力纖維的消失，這提示我們DE

12、NV是通過改變actin來進(jìn)入細(xì)胞的；②利用免疫熒光雙染色進(jìn)一步觀察感染24，48和96 h的ECV304細(xì)胞actin與DENV-2 E蛋白的細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)actin與E蛋白有明顯的隨感染時(shí)間逐漸增強(qiáng)的共存，提示除了進(jìn)入之外，actin可能參與了DENV-2顆粒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸?shù)绕渌腥具^程。
　　 4.F-actin結(jié)合DENV-2 EDⅢ的方式及結(jié)合殘基的預(yù)測：①從PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載天然結(jié)構(gòu)的F-actin和可

13、溶性的DENV-2 EDⅢ蛋白結(jié)構(gòu)，采用ZDOCK軟件將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)傳輸?shù)嚼顺碧焖蟾咝阅芊?wù)器集群完成對actin和EDⅢ蛋白的分子對接，根據(jù)得分情況獲得5個(gè)最佳結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)；②采用KFC2軟件對這5個(gè)復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)合殘基的預(yù)測，分析了F-actin和EDⅢ蛋白結(jié)構(gòu)中最可能發(fā)生相互結(jié)合的殘基位點(diǎn)。
　　 綜上所述，本研究用純化的DENV-2 EDⅢ蛋白代替全病毒顆粒，建立了改良VOPBA技術(shù)篩選人血管內(nèi)皮細(xì)胞登革病毒相互作用蛋白

14、，卻意外發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞骨架的actin在DENV-2的整個(gè)感染過程中都起了非常重要的作用，參與病毒的進(jìn)入、胞內(nèi)運(yùn)輸及釋放等過程。由于actin與EDⅢ蛋白在體外能發(fā)生相互作用，并與E蛋白在體內(nèi)有隨感染時(shí)間逐漸增強(qiáng)的共存，提示EDⅢ蛋白可能是病毒與actin相互作用的重要組分，并且我們利用生物信息學(xué)軟件對actin與DENV-2 EDⅢ蛋白可能的結(jié)合方式和結(jié)合殘基進(jìn)行了預(yù)測。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)設(shè)計(jì)蛋白突變體深入研究兩者相互關(guān)系，揭示DENV