腸桿菌科細(xì)菌qnrB介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景及目的： 1998年Martinez-Martinez等最早發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌UAB1上存在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance，PMQR)。Qnr通過與DNA回旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ結(jié)合而抑制環(huán)丙沙星的作用從而導(dǎo)致大腸埃希菌J53接合子的耐藥性升高。不少研究顯示qnr在全球范圍內(nèi)存在。迄今已發(fā)現(xiàn)qnr多個(gè)亞型，如qnrA、qnrB、qnrS、qnrC。200

2、6年美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的qnrB是一種全新的基因型，與qnrAl的核苷酸同源性僅為49.5％(氨基酸同源性39.5％)，其分布有待研究，來源尚不清楚。目前僅印度、美國、臺灣和韓國有關(guān)于檢出qnrB的報(bào)道，qnrB常與產(chǎn)SHV-12、C17X-M-15、IMP-8與DHA等β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細(xì)菌密切相關(guān)。我們對2005年10月至2006年4月間我院分離的120株頭孢菌素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測、接合驗(yàn)證等以研究qnrA、qnrB的分

3、布，同時(shí)對qnr陽性菌株產(chǎn)SHV或CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶的情況進(jìn)行初步分析，從而為PMQR的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．細(xì)菌的鑒定和藥敏采用Microscan Walkaway 40<'R>全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。 2．采用堿裂解變性法(E.Z.N.A<'TM> plasmid mini Kit)提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，PCR法檢測qnr的存在，qnrA和qnrB的引

4、物分別為A-F(5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG)、A'R(5’-GAGATTGGCATTGCTCCAG T)及Mrq1、MFQ2，產(chǎn)物大小分別為413bp、469bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳、成像。每次均設(shè)陽性對照和陰性對照，參考菌株K.pneumoniae UAB1(qnrA)及E. coli J53 plus pMG298(qnrB)由上海華山醫(yī)院抗生素研究所王明貴教授和美國Lahey Clinic的G．A．

5、Jacoby教授饋贈。 3．接合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證qnr的轉(zhuǎn)移性，受體菌為E coli J53(Azide resistant)，對接合子的選擇采用含1 00μg/mL氨芐西林、100μg/mL疊氮鈉、8μg/mL頭孢噻肟的胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)，將接合子分別接種至含與不含0.06μg/mL環(huán)丙沙星的TSA平板上觀察喹諾酮類藥物耐藥性的轉(zhuǎn)移。 4．比較受體菌、供體菌及接合子的MIC值，包括多種喹諾酮類藥物，采用瓊脂對倍稀釋法。

6、 5．PCR法分別檢測qnrA、qnrB陽性菌株orf13或orf1005的存在。采用引物qnrB/B’-CDS擴(kuò)增qnrB的全序列，由Invitrogen公司采用ABIPRISM<'TM> 3730XL DNAAnalyzer測序，結(jié)果于www．ncbi．nlm．nih．gov上進(jìn)行GenBank+EMBL+DDBJ比對。 6．對來自同一患者的不同菌種進(jìn)行檢測以了解qnr在體內(nèi)是否存在水平傳播。一株鮑曼不動桿菌同時(shí)包含

7、qnrA、qnrB，純化PCR產(chǎn)物后連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，采用抗生素平板篩選單克隆菌落。對經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆，提純質(zhì)粒DNA完成測序。 7．采用Nitrocefin法檢測供體菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況，改良三維實(shí)驗(yàn)了解細(xì)菌產(chǎn)酶表型，Multiplex-PCR法檢測blasnv、blacTX-M及多種質(zhì)粒型AmpC酶的bla基因(包括DHA、MOX、CIT、ACC、FOX等)。

8、 結(jié)果： 1．qnr的檢出：120株腸桿菌科細(xì)菌中，分別有37株含qnrA，33株含qnrB，其中13株同時(shí)檢出qnrA、qnrB；其中腸桿菌屬、克雷伯菌屬細(xì)菌及大腸埃希菌qnr的檢出率分別為52.9％、57.1％和50.0％。 2．接合實(shí)驗(yàn)：除一株肺炎克雷伯菌外其余56株接合子均能在TSA選擇平板上生長；而一株接合子在含環(huán)丙沙星的TSA上不能生長。 3．MIC測定：各種抗菌藥物對接合子的MIC值較受體菌均有

9、不同程度提高。僅加替沙星、頭孢吡肟對qnr陽性菌株的抗菌活性相對較好。 4．orf513及orf1005檢測：qnrA、qnrB陽性菌株中各有7株檢測到orf513或D饑005的存在。 5．qnrB全序列擴(kuò)增：18株細(xì)菌可擴(kuò)增出681bp或645bp的全序列片段。部分菌株的qnrB序列與qnrBl(DQ351241)完全一致，但4株細(xì)菌的qnrB序列與qnrB3(DQ303920)相比，存在3個(gè)位點(diǎn)核苷酸序列突變(201

10、 A→T，271位T→G，498位G→A)而導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的氨基酸存在兩個(gè)位點(diǎn)差異：第67位、91位分別由賴氨酸、絲氨酸變成天冬酰胺及丙氨酸(K67N，S91A)。 6．qnr在患者體內(nèi)水平傳播：5個(gè)患者在首次檢出qnr后，相同患者后續(xù)分離到的其它菌種中(7株/5人)，僅1株不含qnr基因。且對于同一患者，后續(xù)分離到的菌株與首次檢出株含有同一類型的qnr，也可能同時(shí)包含qnrA、qnrB。鮑曼不動桿菌的qnrB部分序列與qnr

11、B1完全一致，qnrA部分序列與qnrAl相比有一個(gè)核苷酸改變(167位C→T)。 7．供體菌β-內(nèi)酰胺酶檢測：所有細(xì)菌均可使Nitrocefin紙片變紅色；33株細(xì)菌產(chǎn)ESBls或AmpC酶。49株(89.1％)供體菌包含bla<,SGW>或blacTX-M；約70.0％的qm’陽性菌可檢測到AmpC β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)的bla基因，以DHA型及MIR-1T、ACT-1型為主。 結(jié)論： 1．2005年10月-20