腸桿菌科臨床株質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、腸桿菌科細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性日益加重，以往喹諾酮類的耐藥研究多集中在染色體介導(dǎo)的靶位改變、膜通透性降低、外排泵亢進(jìn)機(jī)制，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥罕見報(bào)道。qnrA是首次報(bào)道的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因，由MartilqeZ-MartiFlez等在1株肺炎克雷伯菌中檢出，作用機(jī)制是其編碼的蛋白能保護(hù)喹諾酮類作用的靶位導(dǎo)致耐藥。喹諾酮類是人工合成的藥物，一直認(rèn)為不受修飾酶影響，最近Robicsek等首次報(bào)道了喹諾酮類修飾酶基因aac(6’)

2、-Ib-cr，其也位于質(zhì)粒上，它本質(zhì)上是一種普通氨基糖甙類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac(6’)-Ib的變異體，第223和454位兩處堿基的突變賦予了其修飾喹諾酮類的特性，但只能修飾含游離氨基的喹諾酮類且僅介導(dǎo)低水平耐藥，研究發(fā)現(xiàn)該變異體仍能修飾普通型aac(6’)-Ib的底物但作用輕度降低，故其能修飾氨基糖甙類和喹諾酮類兩種完全不同類的抗生素而致耐藥。本研究以2001-2002年從我市八家醫(yī)院分離的腸桿菌科臨床株著手，研究細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類

3、耐藥機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用抗生素、控制耐藥基因的播散提供理論依據(jù)。 第一部分：耐環(huán)丙沙星腸桿菌科臨床株中qnrA基因的檢測(cè) 目的： 調(diào)查2001-2002年天津地區(qū)八家醫(yī)院收集的116株環(huán)丙沙星耐藥(CPLX MIC≥4ug/ml)的腸桿菌科菌株中qnrA基因的存在狀況。 方法： 1、自2001年3月-2002年12月從天津市八家醫(yī)院收集116株環(huán)丙沙星耐藥(CPLX MIC≥4ug/ml)的腸桿菌

4、科臨床株，包括大腸埃希菌77株，克雷伯菌屬15株，陰溝腸桿菌24株。 2、采用瓊脂稀釋法測(cè)腸桿菌科臨床株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC，按臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLS12006年的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922。 3、應(yīng)用PCR方法調(diào)查qnrA基因在腸桿菌科臨床株中的分布，陰性質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922， qnrA陽(yáng)性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌，由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科李濤碩士提供。 結(jié)果

5、： 116株環(huán)丙沙星耐藥的腸桿菌科臨床株中79(68.1％)株對(duì)環(huán)丙沙星高度耐藥(CPLX MIC≥32ug/ml)；116株環(huán)丙沙星耐藥的腸桿菌科臨床株中未發(fā)現(xiàn)qnrA基因陽(yáng)性株。 結(jié)論：qnrA基因在天津地區(qū)腸桿菌科臨床株中甚為罕見，qnr樣基因的流行狀況有待更加細(xì)致而全面的研究。 第二部分：aac(6’)-Ib-cr基因介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制的研究 目的： 調(diào)查77株環(huán)丙沙星耐藥的大腸埃希菌

6、(同第一部分)中aac(6’)-Ib基因的存在狀況并初步探討其變異體aac(6’)-Ib-cr介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制。 方法： 1、應(yīng)用PCR方法篩查菌株的aac(6’)-Ib基因。 2、瓊脂稀釋法測(cè)aac(6’)-Ib陽(yáng)性菌株對(duì)卡那霉素的MIC，按臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLS12006年的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922。 3、DNA測(cè)序檢測(cè)aac(6’)-Ib-cr基因變異體，從a

7、ac(6’)-Ib陽(yáng)性株中選擇對(duì)卡那霉素耐藥表型不同的部分菌株，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行DNA序列分析。 4、接合傳遞試驗(yàn)方法探討細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性傳遞，大腸埃希菌NK5449作為接合傳遞受體菌株，供體菌株為臨床分離株。在含卡那霉素4ug/ml和利福平600ug/ml的LB選擇培養(yǎng)基上篩選接合株，有菌落生長(zhǎng)為接合成功；為進(jìn)一步了解有無(wú)喹諾酮類和氨基糖甙類的耐藥轉(zhuǎn)移，分別測(cè)供體株、受體株、接合株對(duì)喹諾酮類和氨基糖甙類的MI

8、C。 結(jié)果： 1、aac(6’)-Ib的PCR擴(kuò)增，77株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的大腸埃希菌中15株檢出aac(6’)-Ib，其中對(duì)卡那霉素耐藥10株、中介4株、敏感1株。 2、序列分析，從15株aac(6’)-Ib陽(yáng)性株中選出對(duì)卡那霉素耐藥表型不同的6株菌即E13、E14、E40、E60、E74、E75，其中E75為敏感株，E40、E60為耐藥株，其余3株為中介株；6株菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果表明：E

9、60攜帶普通型aac(6’)-Ib，其余5株菌在aac(6’)-Ib的第223位和454位均出現(xiàn)點(diǎn)突變即攜帶aac(6’)-Ib-cr。 3、接合傳遞試驗(yàn)，對(duì)6株測(cè)序的菌株進(jìn)行接合傳遞，其中E13、E14、E40、E60在選擇培養(yǎng)基上有菌生長(zhǎng)接合成功；藥敏結(jié)果表明：攜帶普通型aac(6’)-Ib的菌株E60其接合株與受體株相比，對(duì)3種喹諾酮類藥物的MIC無(wú)差別，而攜帶aac(6’)-Ib-cr的菌株E13、E14、E40其接合株

10、與受體株相比，對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星(二者含游離氨基)的MIC提高了2個(gè)稀釋度，對(duì)左氧氟沙星的MIC無(wú)變化，兩種來(lái)源的接合株的共同之處在于對(duì)卡那霉素和慶大霉素的MIC均比受體株明顯提高。 結(jié)論： 1、天津地區(qū)大腸埃希菌臨床株中首次發(fā)現(xiàn)了aac(6’)-Ib-cr基因。 2、aac(6’)-Ib-cr對(duì)菌株的喹諾酮類和氨基糖甙類抗生素的耐藥起到一定的作用，由于耐藥基因位于質(zhì)粒上增加了耐藥性水平播散的危險(xiǎn)。 3

11、、本研究的創(chuàng)新點(diǎn)： 第一同時(shí)對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的兩種喹諾酮耐藥機(jī)制進(jìn)行了研究，本研究對(duì)天津地區(qū)116株腸桿菌科臨床株篩查qnrA未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性株，但其實(shí)際流行狀況尚待深入調(diào)查；首次在天津地區(qū)發(fā)現(xiàn)了aac(6’)-Ib-cr，國(guó)外學(xué)者Robicsek首次報(bào)道了aac(6’)-Ib-cr并進(jìn)一步對(duì)中國(guó)上海大腸埃希菌中該基因的流行狀況進(jìn)行調(diào)查，除上海外國(guó)內(nèi)尚無(wú)其他地方出現(xiàn)aac(6’)-Ib-cr的報(bào)道。 第二根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果提出一個(gè)假設(shè)：慶