體外誘導(dǎo)哈維氏弧菌對喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）主要分布于海洋環(huán)境和海洋生物體中，是多種海洋魚類和無脊椎動物的條件致病菌?；【〉姆乐沃饕蕾囉诳股睾突瘜W(xué)藥物，喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌對此類藥物的耐藥性日趨顯著。目前，缺乏哈維氏弧菌對于喹諾酮藥物耐藥機(jī)制的相關(guān)研究。
　　本研究以哈維氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33843和臨床分離的敏感菌株為研究對象，在含亞抑菌濃度諾氟沙星的培養(yǎng)基上進(jìn)行逐步誘導(dǎo)，分別對誘導(dǎo)前

2、后菌株耐藥性和生物學(xué)特性進(jìn)行檢測。結(jié)果成功篩選了兩株高水平喹諾酮耐藥菌株（MIC為512～1024μg/ml），耐藥性能穩(wěn)定遺傳并且呈現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象。耐藥株與敏感株相比泳動能力和生物膜形成能力均顯著上升，生長曲線無明顯變化。
　　利用PCR擴(kuò)增和基因測序的方法檢測各誘導(dǎo)菌株靶基因gyrA、gyrB、parC、parE的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)，并加入外排泵抑制劑(CCCP)抑制細(xì)菌主動外排系統(tǒng)，測定不同藥物對細(xì)菌的MIC。結(jié)果

3、顯示隨著誘導(dǎo)菌株MIC值的不斷增加，靶基因上逐漸產(chǎn)生了突變，先是gyrA第83位Ser發(fā)生單點(diǎn)突變?yōu)镮le，之后parC基因上的第85位Ser突變?yōu)門yr或Phe，gyrB和parE未檢測到突變。加入CCCP后，耐藥菌的MIC值均有所下降。提示哈維氏弧菌對喹諾酮類耐藥可能存在靶基因突變及外排泵等多種耐藥機(jī)制。
　　通過RNA-seq技術(shù)對臨床分離的哈維氏弧菌的敏感菌株(VS)和耐藥株(VR)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)從頭拼接(De n

4、ove)再組裝共得到2，082條Unigene。通過比對，兩個(gè)樣品共鑒定出129個(gè)差異表達(dá)基因，耐藥菌與敏感菌相比有65個(gè)基因上調(diào)，64個(gè)下調(diào)。對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)雙組份系統(tǒng)(ko02020)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ko02010)、鞭毛組裝(ko02040)通路顯著富集，并找到與喹諾酮耐藥相關(guān)的9個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示哈維氏弧菌的耐藥機(jī)制除了經(jīng)典的靶位點(diǎn)突變外，主動外排系統(tǒng)、雙組份系統(tǒng)與鞭毛組裝等調(diào)節(jié)機(jī)制也參與耐藥

5、的形成。
　　利用RT-PCR技術(shù)在優(yōu)化的熒光定量PCR的反應(yīng)條件下對10個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的基因表達(dá)趨勢基本一致，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析的可靠性。
　　對預(yù)測的哈維氏弧菌喹諾酮耐藥基因qnr進(jìn)行克隆和原核表達(dá)優(yōu)化，結(jié)果表明哈維氏弧菌qnr全長651bp，編碼216個(gè)氨基酸;重組蛋白優(yōu)化條件為28℃、IPTG濃度為0.05 mmol/L條件下誘導(dǎo)6h。獲得的哈維氏弧菌QNR蛋白為下一