腺病毒轉(zhuǎn)染核糖體蛋白基因RPS26對人結(jié)外鼻型NK-T細(xì)胞淋巴瘤生長分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤(Human Nasal type NK／T cell1ymphoma)是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)行為，多原發(fā)于淋巴結(jié)外器官或組織，存在高水平EB病毒感染的腫瘤。該腫瘤常表達(dá)T細(xì)胞分化抗原及自然殺傷(Natural Killer，NK)細(xì)胞相關(guān)抗原，故此得名。目前認(rèn)為T細(xì)胞、NK細(xì)胞具有共同始祖細(xì)胞(P-T／NT細(xì)胞)，在不同條件下可向T細(xì)胞或NK細(xì)胞分化。人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤可能來源于具有

2、雙向分化潛能的P-T／NT細(xì)胞，其瘤細(xì)胞的分化已超越前體細(xì)胞階段(P-T／NT細(xì)胞、P-T細(xì)胞和P-NK細(xì)胞)，但尚未達(dá)到成熟T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞的階段。新版WHO關(guān)于淋巴造血組織腫瘤的分類已將其列為一個(gè)獨(dú)立的淋巴瘤類型。人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤在亞洲及南美洲發(fā)病率較高，西歐和北美地區(qū)少見，故該腫瘤是亞洲、也是中國的“特產(chǎn)”。四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科每年診斷該類腫瘤60余例，約占所有淋巴瘤的13.85％，約占非霍奇金淋巴瘤的16％。

3、 人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤多發(fā)于中線面部，局部活檢組織多較小，除做病理診斷和免疫表型檢測外所剩無幾，故實(shí)驗(yàn)材料的匱乏嚴(yán)重制約該腫瘤的深入研究。 我課題組經(jīng)過三年多的工作成功建立人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型，獲贈(zèng)了該腫瘤的兩株細(xì)胞系SNT-8、SNK-6，這對該腫瘤的深入研究提供了條件。目前，關(guān)于該腫瘤發(fā)病及腫瘤演進(jìn)的分子機(jī)制方面的研究報(bào)道很少，本課題組前期完成了1例人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤cDNA芯片腫瘤相

4、關(guān)基因的篩查檢測，發(fā)現(xiàn)了多條表達(dá)水平異常的基因，為今后的研究指明了方向。人結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤人類表達(dá)譜cDNA芯片篩查結(jié)果表明：所檢測的14條核糖體蛋白基因(ribOSOmal protein gene，RPG)表達(dá)水平均呈明顯下調(diào)。RPG所編碼的核糖體蛋白在細(xì)胞的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，一方面核糖體蛋白是核糖體的重要組成部分，參與蛋白質(zhì)的合成，另一方面核糖體蛋白對細(xì)胞的生長發(fā)育有直接的調(diào)控功能。近年來的研究表明在多種腫

5、瘤中都發(fā)現(xiàn)存在核糖體蛋白基因表達(dá)水平的改變。RPG mRNA在人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)情況如何?這一事件在人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤生長發(fā)育過程中具有什么樣的作用?尚未見相關(guān)研究報(bào)道。 本研究嘗試以反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織作為對照，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對一組人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤病例進(jìn)行核糖體蛋白基因RPS13和RPS26轉(zhuǎn)錄水平的檢測，觀察RPS13和RPS26基因在該腫瘤組織中的表達(dá)情況；并構(gòu)建RPS2

6、6基因腺病毒表達(dá)載體，建立RPS26腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建方法；用構(gòu)建的RPS26基因腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNT-8、SNK-6和裸鼠動(dòng)物模型，并觀察腫瘤細(xì)胞RPS26 mRNA表達(dá)水平的變化，繪制細(xì)胞系、動(dòng)物模型生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期，動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞系、動(dòng)物模型腫瘤細(xì)胞生長情況；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞分化相關(guān)抗原，觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞系、裸鼠模型腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)，旨在探討腺病毒轉(zhuǎn)染核糖

7、體蛋白基因RPS26對人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤生長和分化的影響，初步了解該基因功能。 主要研究結(jié)果如下： 1．以反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織作為對照，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對20例人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行RPSl3、RPS26基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測。結(jié)果顯示所有樣本的RPSl3、RPS26基因mRNA表達(dá)水平較對照明顯下調(diào)，RPS26基因下調(diào)尤為顯著。 2．成功構(gòu)建RPS26基因腺病毒表達(dá)載體Ad-RPS26。腺

8、病毒轉(zhuǎn)染效率高，滴度高。摸索出了一套高效構(gòu)建RPS26基因腺病毒表達(dá)載體的技術(shù)方法。 3．使用RPS26基因腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6和SNT-8，腫瘤細(xì)胞RPS26 mRNA表達(dá)水平明顯升高，兩株細(xì)胞的生長均受到抑制，表現(xiàn)出倍增時(shí)間明顯延長，細(xì)胞周期出現(xiàn)G<,1>～S期阻滯，GO～G1期細(xì)胞數(shù)目增多，S期細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞表現(xiàn)出向T細(xì)胞方向分化的趨勢；使用該腺病毒載體對人結(jié)外鼻型’NK／T細(xì)

9、胞淋巴瘤動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)后，瘤體組織腫瘤細(xì)胞RPS26mRNA表達(dá)水平明顯升高，動(dòng)物模型瘤體組織生長減慢，腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期出現(xiàn)G<,1>～S期阻滯。 綜上所述，本研究證實(shí)了人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤中RPSl3、RPS26基因轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，可能是人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤的重要事件。成功構(gòu)建RPS26基因腺病毒表達(dá)載體，摸索出了一套高效制備RPS26基因腺病毒表達(dá)載體的技術(shù)方法。RPS26腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)外鼻型N

10、K／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型后腫瘤細(xì)胞RPS26 mRNA水平明顯升高，腺病毒載體對該腫瘤是高效的基因轉(zhuǎn)移載體。使用Ad-RPS26干預(yù)人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(SNK-6和SNT-8)和裸鼠動(dòng)物模型，二者的RPS26 mRNA表達(dá)水平均明顯升高，其腫瘤細(xì)胞的生長均受到抑制，細(xì)胞系SNK-6和SNT-8表現(xiàn)出向T細(xì)胞分化的趨勢。核糖體蛋白基因RPS26參與了人結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤細(xì)胞的生長分化過程，其主要作用是抑