免疫球蛋白輕鏈克隆性重排分析在B-NHL分子病理診斷中的初步研究.pdf

1、淋巴瘤由于其分類復(fù)雜,對(duì)其診斷主要依賴形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方法,Southern blot也曾成為診斷淋巴瘤的"金標(biāo)準(zhǔn)",但是都有其缺陷,形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)雖然能有助于正確的診斷和分類,但是仍然有一部分病例不能得到確診,Southern blot借助分子病理學(xué)的方法對(duì)淋巴瘤進(jìn)行診斷特異性和敏感性較高,但是由于其存在以下局限性,如費(fèi)時(shí),要求的DNA質(zhì)量較高(10-20μg),不適于在臨床常規(guī)推廣開展.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)快捷,方便,用

2、于淋巴瘤的診斷受到人們的關(guān)注. Southern blot和PCR檢測(cè)淋巴瘤的理論依據(jù)在于:腫瘤的所有細(xì)胞均來(lái)源一個(gè)克隆(clone),理論認(rèn)為正常發(fā)育的B細(xì)胞和T細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)免疫球蛋白(immunoglobulin,lg)基因重排和T細(xì)胞受體重排(T cell receptor,TCR).淋巴組織良性增生性疾病中表現(xiàn)為Ig基因和(或)TCR基因多克隆重排.而腫瘤細(xì)胞起源于一個(gè)克隆,在淋巴瘤中就表現(xiàn)為Ig基因或者TCR基因單克隆

3、重排.PCR檢測(cè)淋巴瘤的克隆性正式檢測(cè)淋巴瘤的Ig基因重排和TCR基因重排. 目前淋巴瘤的分子病理診斷在臨床實(shí)踐中存在以下幾方面問題: 首先,以往研究Ig基因克隆性重排主要集中在重鏈(heavy chain)可變區(qū)基因,之所以IgH成為檢測(cè)的首選目標(biāo),主要的原因是大多數(shù)的B細(xì)胞腫瘤有IgH基因重排,IgH基因重排發(fā)生在IgL基因重排之前,一些B細(xì)胞惡性腫瘤尤其是一些前體淋巴母細(xì)胞白血病和淋巴瘤部分沒有進(jìn)行IgL基因重排.

4、 第二方面,目前,世界范圍內(nèi)在應(yīng)用IgH重排檢測(cè)淋巴瘤時(shí)還有不少困難,如假陽(yáng)性、假陰性、雙克隆以及寡克隆的意義等問題.世界各國(guó)還在尋找各種方案解決這些問題,其中BIOMED-2方案的出現(xiàn)就是其中之一,BIOMED-2方案是歐洲7個(gè)國(guó)家的47個(gè)研究所合作產(chǎn)生的一個(gè)關(guān)于淋巴瘤分子病理診斷的方案.該方案的產(chǎn)生旨在對(duì)淋巴瘤分子病理診斷方案的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化,但是目前的方案體系太復(fù)雜,一個(gè)PCR反應(yīng)體系需要多條引物,如IgH PCR的反應(yīng)體

5、系多大21條引物之多,根據(jù)該方案的設(shè)計(jì),完成一例淋巴瘤檢測(cè)成本會(huì)很高.鑒于此,這個(gè)方案目前還在改進(jìn)、簡(jiǎn)化和探索中. 值得注意的是,多年來(lái)人們都依據(jù)IgH來(lái)進(jìn)行克隆性檢測(cè),而在應(yīng)用IgL方面,臨床實(shí)踐和研究均不多.理論上認(rèn)為輕鏈由于其CDRs區(qū)的體細(xì)胞超突變可能低于重鏈CDRs區(qū).目前關(guān)于輕鏈克隆性重排研究的資料積累有限,但是理論上和已經(jīng)發(fā)表的一些研究成果可知在淋巴瘤中對(duì)輕鏈的研究在一定程度上能夠輔助重鏈克隆性重排檢測(cè).因而我們依

6、據(jù)我們多年的工作基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件,對(duì)IgL在淋巴瘤分子病理診斷中的作用作初步的研究,以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù). 第三方面,目前現(xiàn)有研究表明,IgH基因克隆性重排檢測(cè)與淋巴瘤的起源有緊密的聯(lián)系.來(lái)源于幼稚淋巴細(xì)胞,也稱為生發(fā)中心前(pregerminal centre,pre-GC)幼稚B細(xì)胞的腫瘤,通常表達(dá)未突變的IgH可變區(qū)(VH)基因,顯示有高的IgH克隆性重排檢測(cè)率,而另一些來(lái)源于記憶性B細(xì)胞,在生發(fā)中心(germina

7、l center,GC)發(fā)生的的腫瘤細(xì)胞通常有體細(xì)胞超突變的VH基因(GC和post-GC記憶B細(xì)胞),顯示有較低的克隆性重排檢測(cè)率. Ig基因的CDRs體細(xì)胞超突變?cè)试S抗體和靶抗原親合力成熟而導(dǎo)致B細(xì)胞選擇.這些體細(xì)胞突變也會(huì)發(fā)生在FR,FR區(qū)是大多數(shù)通用和家族引物設(shè)計(jì)區(qū).突變得最終結(jié)果就是導(dǎo)致一致靶序列丟失還有靶位點(diǎn)的改變,該改變會(huì)影響引物得最佳匹配.通用性引物和家族性引物的總體上來(lái)講對(duì)相當(dāng)一部分的基因是最適的,但是對(duì)其它一

8、部分基因也顯示了較低的同源性. 第四方面,早期報(bào)道的淋巴瘤基因檢測(cè)中存在雙重重排的現(xiàn)象,當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為免疫表型為B細(xì)胞或者T細(xì)胞的淋巴瘤同時(shí)發(fā)生IgH基因及TCR基因的克隆性重排稱為雙重重排(dual rearrangements).同時(shí)也有研究報(bào)道免疫表型為B細(xì)胞的淋巴瘤同時(shí)發(fā)生IgH兩個(gè)等位基因的克隆性重排稱為雙克隆重排(biclonalrearrangement);T細(xì)胞中發(fā)生兩個(gè)等位基因的克隆性重排也稱為雙克隆重排.本文

9、中所涉及的雙重重排現(xiàn)象指同時(shí)發(fā)生IgH基因和TCR基因的克隆性重排.克隆性雙重重排的現(xiàn)象逐漸受到關(guān)注,PCR檢測(cè)到的雙重重排的淋巴瘤是否真正發(fā)生了雙重重排?其臨床預(yù)后同一般發(fā)生重排的淋巴瘤有何不同?其發(fā)生機(jī)制又是怎樣? 依據(jù)重排機(jī)制,B-NHL先發(fā)生IgH重排,重排成功發(fā)生IgK重排,而后發(fā)生Igλ重排,對(duì)于雙重重排研究引入輕鏈重排的概念,可以初步嘗試揭示PCR檢測(cè)到的雙重重排是否真正發(fā)生了雙重重排,及對(duì)雙重重排的發(fā)生機(jī)制做一些

10、初步的探討. 鑒于以上資料,本研究首先采用PCR方法,聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物,檢測(cè)77例B-NHL的IgH基因及TCRγ基因克隆性重排,測(cè)定IgH基因克隆性重排在本實(shí)驗(yàn)室B-NHL中的檢測(cè)率,研究IgLPCR在B-NHL中的應(yīng)用,同時(shí)選出雙重重排的病例進(jìn)一步通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)和輕鏈基因克隆性重排研究雙重重排的現(xiàn)象. 材料與方法： 1 材料 (1) NHL標(biāo)本:收集1997-2007年我醫(yī)學(xué)院

11、附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的B-NHL標(biāo)本77例,全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片,除常規(guī)HE染色外,采用LCA(2B11,DAKO)、CD3(F7.2.38,DAKO),CD45RO(OPD4,DAKO)、CD20(L26,DAKO)免疫組化S-P法標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞群,根據(jù)腫瘤的免疫表型,確定為B-NHL,按照2000年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有病例進(jìn)行分類, kappa light chain(

12、L1C1,DAKO)和lambda lightchain(LAM03+HP6054,DAKO)標(biāo)記輕鏈. (2)對(duì)照組標(biāo)本:收集反應(yīng)性淋巴結(jié)炎石蠟標(biāo)本2例. 2 方法 (1) 經(jīng)典蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA. (2) 采用PCR方法,聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物,檢測(cè)77例NHL標(biāo)本IgH基因及TCRγ基因克隆性重排,產(chǎn)物先2﹪瓊脂糖電泳初篩,后行8﹪變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析.

13、 (3) 采用PCR方法,檢測(cè)IgL,基因克隆性重排,包括Igк基因克隆性重排和Igλ基因克隆性重排,產(chǎn)物先經(jīng)2﹪瓊脂糖電泳初篩,后行8﹪變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析.克隆測(cè)序分析. 結(jié)果： 1.采用FR3A引物,克隆性IgH基因重排在77例B-NHL中檢測(cè)率為62.3﹪(48/77),聯(lián)合FR3A、FR2A引物,總檢測(cè)率為75.3﹪(58/77). 2.聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物,6.5﹪(5/77)N

14、H[,初步檢測(cè)到發(fā)生雙重重排.免疫組化結(jié)果提示這5例均為B細(xì)胞表型.病理類型分別為2例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、2例MALT-MZI,及1例濾泡性淋巴瘤(FL). 3.克隆性Igκ基因重排在77例B-NHL中檢測(cè)率為11.7﹪(9/77),克隆性Igλ基因重排檢測(cè)率為6.5﹪(5/77),聯(lián)合IgL,基因重排,克隆性基因重排在77例B-NHL,中檢測(cè)率是18.2﹪(14/77). 結(jié)論： 1.采用FR3A

15、引物,克隆性IgH基因重排在B-NHL中檢測(cè)率為62.3﹪,聯(lián)合FR3A、FR2A引物,可提高檢測(cè)率到75.3﹪. 2.Igr基因重排克隆性分析檢測(cè)率11.7﹪,Igλ基因重排克隆性分析檢測(cè)率6.5﹪,克隆性IgH基因重排檢測(cè)率是18.2﹪,聯(lián)合應(yīng)用IgH和IgL基因克隆性分析能夠提高檢測(cè)率(從75.3﹪到84.5﹪).克隆性IgL基因重排能提高淋巴瘤的檢測(cè)率. 3.雙重重排現(xiàn)象在我們實(shí)驗(yàn)室惡性淋巴瘤中的初步檢測(cè)率為6.