B-NHL中LgVH克隆重排及分子特征的研究.pdf

1、惡性淋巴瘤發(fā)病的分子機制是當前腫瘤研究的熱點。惡性淋巴瘤作為我國常見惡性腫瘤之一,從分子病理學和分子遺傳學水平來探討其相關基因的特征和發(fā)病機制,以期建立相應的分子標記,進一步協(xié)助診斷、判斷預后、并為進一步的預防提供新思路,已成為目前國內(nèi)外淋巴瘤研究的主要方向。
　　 免疫球蛋白重鏈(IgH)基因是成熟B細胞正常表達的基因。在正常淋巴細胞的發(fā)育過程中,IgH基因的4個分離的編碼序列,即可變區(qū)(V)、多變區(qū)(D)、連接區(qū)(J)和恒定

2、區(qū)(C)會發(fā)生隨機重排組合成一個有結構的基因。組合后的IgH基因主要包括三個框架區(qū)(FRs)和三個互補決定區(qū)(CDRs)。IgH基因的重排形式是淋巴瘤最重要的輔助診斷之一,而且其重鏈可變區(qū)(IgVH)的突變狀態(tài)可反映B細胞腫瘤的起始來源,進一步的研究發(fā)現(xiàn)IgVH基因的突變狀態(tài)與某些淋巴瘤的惡性程度及預后相關。
　　 在生發(fā)中心的發(fā)育過程中,遭遇抗原的識別主要發(fā)生在互補決定區(qū),發(fā)生體細胞超突變(SHM)。在此期間,Ig基因的V段產(chǎn)

3、生高頻點突變,致使B細胞產(chǎn)生高親合力的IG分子。這個過程易受內(nèi)、外因素(如個體遺傳差異、病毒感染等)干擾而出現(xiàn)差異,構成了淋巴瘤發(fā)生的重要高危因素。SHM是B細胞發(fā)展階段的一個重要標志,目前認為Ig的SHM是細胞來源于生發(fā)中心的標記。IgVH基因的SHM分析使得人們對B細胞和其惡性腫瘤的發(fā)展過程以及一些B細胞腫瘤的亞型有了更深刻的了解。研究還發(fā)現(xiàn)不同的淋巴瘤所使用的VH基團家族存在著差別,有的淋巴瘤對特定的VH基因家族有著特殊的偏好,即

4、所謂的VH基因偏向性使用,這一分子遺傳學上的特征在淋巴瘤發(fā)病中的意義也值得深入研究。
　　 近年來國外學者利用基因掃描(Genescan)技術,可精準分析IgVH基因的克隆重排狀態(tài),歸納重排類型,比常規(guī)PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測更加精確,國外已經(jīng)將它作為分子病理診斷的常規(guī)項目。目前國內(nèi)尚開展的較少,本研究將對PCR基礎上的基因掃描技術在淋巴瘤診斷中的應用進行探討。
　　 我們采用通用引物FR3A和FR2A,檢測了70例常見

5、類型的B-NHL(主要包括DLBCL、MALT、FL、MCL及CLL)的IgVH基因克隆重排,其中63例用FR3A引物檢測陽性,陽性率90.0％;38例用FR2A引物檢測陽性,陽性率54.3％;65例用FR3A或者FR2A引物檢測陽性,陽性率92.9％。
　　 基因掃描可以快速有效地區(qū)分相同或不同克隆的PCR產(chǎn)物。我們用熒光染料標記上游引物(或下游引物),采用DNA分析儀以及GeneMapper軟件(GeneMapper3.1,

6、ABI)對PCR產(chǎn)物進行分析。在研究中我們發(fā)現(xiàn),瓊脂糖凝膠電泳下顯示為單條條帶的病例經(jīng)基因掃描檢測后,單克隆重排及雙克隆重排檢出率只有70％左右。通過對瓊脂糖凝膠電泳與基因掃描檢測的結果進行比較,我們發(fā)現(xiàn)瓊脂糖電泳檢測為單條條帶的病例,基因掃描檢測結果并不為單克隆重排,以FR3A為例,其中雙克隆重排6例,寡克隆重排3例,多克隆重排3例;而作為對照的慢性扁桃炎有時在凝膠電泳下也為單條條帶,經(jīng)基因掃描檢測后明確了其多克隆重排的特征。這一結果

7、說明常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳技術檢測重排不能用于判斷淋巴瘤的克隆重排類型。而PCR基礎上的基因掃描技術能夠彌補這一缺陷,成為淋巴瘤分子診斷的重要手段。在國外它已經(jīng)被作為淋巴瘤診斷的常規(guī)檢測方法,而國內(nèi)尚有待開展。
　　 我們把FR2A陽性的DLBCL病例進行測序,將測序結果和IgBLAST數(shù)據(jù)庫上的序列比對分析,進一步探討DLBCL中IgVH基因的分子特征。本研究中測序成功17例DLBCL(17/52),免疫組化結果顯示3例為生發(fā)中

8、心型DLBCL,其余14例均為非生發(fā)中心型DLBCL,測序結果顯示它們都攜帶突變型IgVH基因,都為生發(fā)中心或生發(fā)中心后的DLBCL,主要表現(xiàn)為核苷酸的替換。
　　 目前對DLBCL中VH基因的偏向性使用還存在著爭議,Lossos等人對53例VH片段的偏向性分析發(fā)現(xiàn)DLBCL所攜帶的VH基因家族比率與正常血液中的B細胞相似。而也有相反的報道認為DLBCL中有VH4-34的偏向性使用。本研究測序成功的17例DLBCL中,3例雙克隆

9、樣本的VH片段都來自VH3和VH4家族,其余樣本中,7例使用VH4家族(且VH4-34和VH4-61出現(xiàn)的頻率最高),6例使用VH3家族。此小樣本研究顯示DLBCL傾向使用VH4和VH3家族,還需要擴大樣本進行統(tǒng)計。
　　 綜上所述,我們利用PCR凝膠電泳結合基因掃描技術檢測B-NHL中IgVH基因的克隆性重排,顯示PCR基礎上的基因掃描技術能夠用于B細胞淋巴瘤IgVH基因的重排類型,是淋巴瘤的分子診斷的重要手段。此外,我們結合