β-欖香烯乳對(duì)食管鱗狀癌細(xì)胞株（EC109）體外放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、食管癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率為13/10萬(wàn)，每年新增患者超過(guò)30萬(wàn)人，并且大多數(shù)發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家，在我國(guó)食管癌(esophageal cancer，EC)每年新增診斷病例約25萬(wàn)，尤以我國(guó)北方太行山區(qū)發(fā)病率最高。死亡率為男性27.54/10萬(wàn)，女性14.05/10萬(wàn)，居癌癥死因第4位，是威脅人民身體健康的消化道惡性腫瘤之一。食管癌主要有鱗癌(squamous cell carcinoma，SCC)和腺癌(adenocarci

2、noma,ADC)兩種組織形式，它們的病因?qū)W和病理學(xué)特征有很大不同，我國(guó)食管癌占惡性腫瘤發(fā)病率的第四位，并且以鱗癌為主。圍手術(shù)期常輔以放療，如何提高食管磷狀癌細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性，既能按計(jì)劃量照射，又能降低放療對(duì)正常組織的損傷，一直是我們追求的目標(biāo)。研究顯示癌細(xì)胞凋亡增加，有更大的放射敏感性，有學(xué)者將腫瘤細(xì)胞凋亡水平作為腫瘤放射敏感性的衡量指標(biāo)。很多學(xué)者都致力于探索增加細(xì)胞凋亡的方法，以期提高細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性。處于分裂周期不同時(shí)相的

3、細(xì)胞其放射敏感性有很大的差異。放射生物學(xué)研究己證實(shí)，細(xì)胞周期中不同時(shí)相的細(xì)胞放射敏感性有很大差別，G<,2>后期和M期放射敏感性最高。因此，促使腫瘤G<,1>/S期細(xì)胞進(jìn)人并停留在對(duì)放射線(xiàn)敏感的G<,2>/M期，是提高腫瘤放射敏感性、改善療效的一個(gè)重要途徑。 放射增敏劑是指能提高射線(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力，而對(duì)受照射的正常細(xì)胞影響不大的一些物質(zhì)(化學(xué)合成藥物、中草藥及其有效成分、生物制品等)。從20世紀(jì)60年代初期，國(guó)內(nèi)外對(duì)放射增敏劑

4、進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究,多種化學(xué)藥物曾被嘗試用作放射增敏劑，然而臨床效果不理想，并且普遍存在骨髓抑制等毒副反應(yīng)，如5-氟尿嘧啶是放療常用的化學(xué)增敏劑，但毒副反應(yīng)明顯，常出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)。因此研究探索新的高效低毒增敏劑具有實(shí)用價(jià)值，我國(guó)中草藥資源十分豐富，而且蘊(yùn)涵較大的研發(fā)潛力。β-欖香烯乳是從中藥莪術(shù)中提取出來(lái)的具有抗癌活性的國(guó)家二類(lèi)抗癌新藥，對(duì)正常細(xì)胞及組織毒性非常低，副作用輕微，無(wú)明顯肝、腎功能損害，不發(fā)生骨髓抑制，不同于一般的細(xì)胞毒性化療

5、藥物。多項(xiàng)研究表明β-欖香烯乳對(duì)諸多腫瘤有抗癌效應(yīng)，下調(diào)bcl-2基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期分布是其主要抗癌機(jī)制。已有研究證明其可增加癌細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性。本研究用低細(xì)胞毒性濃度β-欖香烯乳作用腫瘤細(xì)胞后，觀(guān)察欖香烯乳對(duì)食管磷狀癌細(xì)胞體外放射增敏作用，并探討其增敏機(jī)制，為臨床研究提供新思路和借鑒，為中藥放射增敏研究提供方法。 目的： 本課題旨在研究β-欖香烯乳對(duì)人食管鱗狀癌細(xì)胞放射敏感性的影響，并探討其相關(guān)機(jī)

6、制，著重解決以下問(wèn)題：1、β-欖香烯乳是否增加人食管鱗狀癌細(xì)胞的放射敏感性及不同濃度一時(shí)間作用后的增敏效果如何。2、探討β-欖香烯乳放射增敏的機(jī)制。 材料與方法： 食管鱗狀癌細(xì)胞株(EC109)由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室保存，β-欖香烯乳由大連金港制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，EC109細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)組用含不同濃度(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、120μg/m

7、L)β-欖香烯乳培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)13一欖香烯乳空白對(duì)照組，然后在不同的照射劑量下照射(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間終止培養(yǎng)，用MTT法和集落形成法測(cè)定不同濃度β-欖香烯乳對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率；MTT法初步判斷其對(duì)EC109細(xì)胞的放射敏感性；集落形成法觀(guān)察β-欖香烯乳對(duì)EC109細(xì)胞的放射增敏作用；流式細(xì)胞術(shù)分析β-欖香烯乳作用前后細(xì)胞周期及凋亡變化；間接免疫熒光聯(lián)合流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-

8、2、Bax的表達(dá)變化：免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀(guān)察Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化。數(shù)據(jù)采用Spss10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)和趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多重比較采用Dunnett法、檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。 結(jié)果： 1. β-欖香烯乳作用細(xì)胞24h后，低濃度20μg/mL反而促進(jìn)細(xì)胞增殖，40μg/mL以上濃度，隨β-欖香烯乳濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加(P<0.05)。 2.不同照射量照

9、射經(jīng)0 μg/mL、40μg/mL β-欖香烯乳作用24h后的細(xì)胞，測(cè)OD值，結(jié)果40μg/mL組OD值均較空白組OD值減小。經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后OD值從0.907±0.053、0.838±0.027、0.774±0.029、0.680±0.013、0.652±0.013分別降至0.800±0.009、0.680±0.009、0.562±0.009、0.454±0.009、0.345±0.009，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組

10、間有顯著性差異(P<0.05)。初步判斷β-欖香烯乳對(duì)EC109細(xì)胞有放射增敏作用。 3.不同照射劑量照射經(jīng)40μg/mL、60μg/mL β-欖香烯乳作用24小時(shí)后的細(xì)胞集落結(jié)果及存活率，與空白組比較均有顯著性差異(P<0.05)。40μg/mL、60μg/mL兩濃度組之間也有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、、6Gy、8Gy照射后細(xì)胞集落數(shù)從88±2.65、74±2.65、55±2.65、48±3.61、

11、38±3.46分別減少至40 μg/mL組78±2.00、60±3.61、49±1.00、31±1.00及60μg/mL組71±2.65、53±1.73、43±2.65、25±5.00、13±3.61。集落形成法進(jìn)一步證明：β-欖香烯乳在低細(xì)胞毒性濃度下對(duì)EC109細(xì)胞有放射增敏作用，隨濃度增加，放射增敏作用增強(qiáng)。 4.不同照射劑量照射經(jīng)60 μg/mL β-欖香烯乳作用48h后的細(xì)胞集落結(jié)果及存活率與60 μg/mL作用24h

12、有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后集落數(shù)從88±2.65、74±2.65、55±2.65、48±3.61、38±3.46分別減少至24h組78±2.00、60±3.61、49±1.00、39±2.65、31±1.00及48h組74±1.00、53±1.00、36±4.58、20±6.08、8±6.46。β-欖香烯乳在低細(xì)胞毒性濃度下對(duì)EC109細(xì)胞有放射增敏作用，隨作用時(shí)間增加，放射增敏作用增強(qiáng)

13、。 5.隨β-欖香烯乳濃度、作用時(shí)間的增加，EC109細(xì)胞的凋亡率有上升趨勢(shì)，由開(kāi)始的0.1％升高到17.6％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間有顯著性差異(P<0.05)β-欖香烯乳作用后細(xì)胞凋亡率增加與濃度、作用時(shí)間成正相關(guān)。 6．β-欖香烯乳作用細(xì)胞后發(fā)生G<,2>/M期阻滯，相同時(shí)間下，藥物濃度越高，G<,2>/M期細(xì)胞比率越高，有上升趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間有顯著性差異(P<0.05)。 7．60 μg/mL β-欖香烯乳作

14、用24h,細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下降，著色減弱；定量結(jié)果顯示：相同時(shí)間，不同濃度β-欖香烯乳作用后，隨藥物濃度增加Bcl-2蛋白平均熒光強(qiáng)度減少(P<0.05)；同一藥物濃度，不同作用時(shí)間，隨作用時(shí)間增加，Bcl-2平均熒光強(qiáng)度也減少(P<0.05)。 8．60 μg/mL β-欖香烯乳作用24h，細(xì)胞Bax表達(dá)增加，細(xì)胞漿著色增強(qiáng)；定量結(jié)果顯示：相同時(shí)間，不同濃度β-欖香烯乳作用后，隨藥物濃度增加Bax蛋白表達(dá)增加(P<0.05)

15、；同一藥物濃度，不同作用時(shí)間，隨作用時(shí)間增加，Bcl．2蛋白表達(dá)也增加(P<0.05)。 結(jié)論： 1．40μg/mL ～120μg/mL β-欖香烯乳對(duì)EC109細(xì)胞有抑制作用，可阻滯細(xì)胞于G2/M期，與濃度成正相關(guān)，隨濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加。 2．β-欖香烯乳在低細(xì)胞毒性濃度下對(duì)．EC109細(xì)胞有放射增敏作用，且具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性，并隨濃度的增加和時(shí)間延長(zhǎng)，放射增敏作用增強(qiáng)。 3．β-欖香烯乳可