中國漢族HLA-Cw基因多態(tài)性及測序分型技術的研究與應用.pdf

1、經(jīng)典的HLA-Cw分子不僅呈遞內源性抗原，而且作為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer Immunoglobulin-like Receptor，KIR)的配體，在調節(jié)NK細胞(NaturalKiller cells)的殺傷功能中起重要作用。隨著HLA-Cw分子生物學功能、HLA-Cw基因與疾病，以及HLA-Cw基因與移植相關性等研究的開展和深入，人們對HLA-Cw基因的傳統(tǒng)錯誤認識被逐漸打破。當前HLA-Cw等位基因多樣性、全長序列

2、SNPs多態(tài)性及表達調控的基礎和應用研究正悄然升起。為此，我們進行HLA-Cw等位基因多樣性、全長序列SNPs遺傳多樣的研究，基于所獲取的全長序列，建立可靠的、適合于中國人群的高通量化HLA-Cw基因測序分型方法，該方法可用于骨髓庫造血干細胞的HLA入庫數(shù)據(jù)常規(guī)檢測、中國人群HLA-Cw基因群體遺傳學和組織配型等相關的研究和應用工作。
　　 HLA-Cw等位基因多樣性研究，本文首先對100份新疆維吾爾族隨機個體的血樣進行了HLA

3、-Cw基因的第2和第3外顯子測序分型，排除罕見等位基因后，出現(xiàn)模棱兩可結果的比例占37％。共檢出了27種等位基因，其中頻率大于10％的2種常見等位基因為Cw*0602和Cw*0102。按與KIR分子識別方式的不同，第1組Cw*01,03，07，08，12,14和第2組Cw*02,04，05，06，15，16，17，18的頻率分別為0.61和0.40，其頻率的分布不同于漢族人群。我們在后來增加的29份維吾爾族隨機捐血者樣本檢測時，檢出了一

4、個Cw*040105新等位基因。
　　 其次是調查漢族人群HLA-Cw基因的分子遺傳多態(tài)性，篩選、發(fā)現(xiàn)和鑒定可能的HLA新等位基因，探討商品化試劑盒的PCR引物、測序引物與中國人群的匹配性，將所獲得的HLA-Cw基因測序分型結果供骨髓移植患者查詢和檢索。共對734份漢族骨髓志愿捐獻者樣本采用Atria AlleleSEQR HLA-Cw Plus商品化試劑盒進行HLA-Cw基因第2、第3和第4外顯子測序分型，共檢出了41種等位基

5、因，頻率大于10％的3種常見等位基因為：Cw*0102>Cw*0702>Cw*0304，基因的多樣性(DP)達0.9281,實際觀察雜合度(H)為0.9196(675/734)，純合子樣本比例占8.04％，表明漢族人群HLA-Cw基因為高度多態(tài)性位點。漢族HLA-Cw分子第1組Cw*01,03，07，08，12,14與第2組Cw*02,04，05，06，15，16，17，18組的頻率分別為0.8243和0.1758，與KIR識別以HLA

6、-Cw分子第1組為主。
　　 734份漢族個體經(jīng)Atria AlleleSEQR HLA-Cw Plus商品化試劑盒檢出了8例PCR-SBT結果“異?！钡臉颖?，經(jīng)分子克隆和單倍體測序，在1個樣本中檢出了Cw*0624新等位基因，另外的2個無關個體樣本中均檢出了Cw*075602新等位基因。其余的5例樣本經(jīng)分子克隆測序以及自行設計的PCR引物再測序，證實了這5例標本用Atria商品化試劑盒初次檢測結果中，均存在Cw*0706等位基

7、因漏檢和丟失現(xiàn)象，未檢出新等位基因。我們總結了這5例樣本等位基因漏檢和丟失的一般特點，闡明等位基因丟失的原因。這5例樣本等位基因漏檢和丟失現(xiàn)象提示：對HLA-Cw分子進行全長序列測定，在豐富和增加國際IMGT/HLA Database數(shù)據(jù)庫中國人群HLA-Cw基因全長序列等基礎數(shù)據(jù)的同時，建立適合于中國人群的測序分型方法十分必要。
　　 為此，我們采用長距離PCR技術和Pfu酶，擴增HLA-Cw基因的全長目的全長序列片段4.5

8、kb，同時設計了12條測序引物進行全長序列雙向測序。對28個漢族個體樣本，我們共檢測出22種等位基因，均向GenBank遞交序列；其中Cw*0706，Cw*030301,Cw*140201的全長序列為首次報道，尤其是Cw*0706內含子序列的獲得，使得我們能夠重新設計對該等位基因測序分型的引物，解決Atria商品化測序分型試劑盒對這一等位基因漏檢的問題。利用群體遺傳學分析方法，將所得HLA-Cw56條序列用clustal軟件進行序列排比

9、，輸入到DnaSP4.0進行多態(tài)性分析，共發(fā)現(xiàn)244個SNPs，10處插入/缺失多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)HLA-Cw基因第四內含子及第五外顯子受到平衡選擇的作用，這些非編碼區(qū)以及以前并沒有受到關注的外顯子(第五外顯子)在進化中受到了特殊的選擇壓力，預示著它們在HLA-Cw基因在免疫系統(tǒng)的進化過程中扮演著重要的角色。
　　 基于本文所測定的HLA-Cw基因全長序列和國際IMGT/HLA Database已有的全長序列，我們設計了1對PCR引物

10、和6條測序引物，進行了PCR擴增和測序反應條件的優(yōu)化，所獲得的堿基序列無背景信號和雜峰，并與商品化測序分型試劑盒進行了質量對比，取得了理想的結果。
　　 最后，論文針對當前骨髓志愿捐獻者的HLA-Cw基因分型尚未納入中華骨髓庫HLA入庫數(shù)據(jù)的常規(guī)檢測、在統(tǒng)計分析當前中華骨髓庫無關/供受者HLA匹配狀況的基礎上，闡明了增加骨髓捐獻者的HLA-Cw基因分型和檢索，可提高當前無關供/受者HLA-A、B、Cw、DRB1和DQB1基因配型