2型糖尿病大鼠血管病變與CRP、MMP-9、TIMP-1關(guān)系的研究及羅格列酮的治療作用.pdf

1、目的：大血管病變是2型糖尿病(type2diabetsmilltus,T2DM)最常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患者死亡的首要原因，其主要的病理變化是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，T2DM血管病變屬慢性炎癥性疾病，炎癥因子如IL-1(inerleukin-1)、IL-6、IL-8、C反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein,CRP)腫瘤壞死因子-α(tumournecrosisfactor-α，TNF

2、-α)等，在T2DM血管病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，炎癥反應(yīng)可增加Ⅳ型膠原酶-基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmealloproteinase-9,MMP-9)的表達(dá)，后者增加可引發(fā)血管基底膜Ⅳ型膠原的過(guò)度降解，是T2DM血管病變的始動(dòng)因素，亦可引起AS及增加斑塊的不穩(wěn)定性而引發(fā)急性心血管事件?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TissueInhibitorofmatrixmetalloproteinase,TIMPs)是MMPs的天然

3、抑制物。正常情況下，98％的MMPs是休眠或被TIMP所抑制，TIMPs以1∶1的克分子比例與MMPs結(jié)合，形成MMP-TIMP的復(fù)合物，從而阻斷MMPs與底物結(jié)合，形成體內(nèi)調(diào)節(jié)MMP活性的重要內(nèi)生性抑制系統(tǒng)。因此，TIMPs表達(dá)上調(diào)會(huì)使MMP-TIMP復(fù)合物增多，抑制MMPs對(duì)ECM的降解。羅格列酮(rosiglitazone,RSG)，是過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ(peroxisomeproliferaor-acivatedrec

4、eptor-γ，PPARγ)的激動(dòng)劑，與PPARγ結(jié)合后激動(dòng)許多基因的轉(zhuǎn)錄，因此，具有多種生物學(xué)效用，它不僅可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，改善胰島素抵抗，降低血糖，近來(lái)的研究還證實(shí)其可作用于巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，羅格列酮是臨床上應(yīng)用最廣泛的噻唑烷二酮類(lèi)藥物，主要用于治療2型DM和肥胖患者，因其生物學(xué)作用的多樣性，我們研究了IL-6、MMP-9、TIMP-1與T2DM血管病變的相關(guān)性，進(jìn)一步證明T2DM血管

5、病變是一種慢性炎性疾病，同時(shí)應(yīng)用羅格列酮進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)IL-6、MMP-9、TIMP-1的影響，試圖了解羅格列酮除降糖作用之外的血管保護(hù)作用。 方法：健康Wistar雄性大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組15只，給予普通飲食；另一組30只大鼠，給予高脂飲食喂養(yǎng)2月，按李光偉HOMA指數(shù)判斷胰島素抵抗成模標(biāo)準(zhǔn)后，腹腔注射STZ造模。將成模大鼠隨機(jī)分為二組(n=15只)：2型糖尿病組(T2DM組)；2型糖尿病羅

6、格列酮治療組(T2DM+RSG組)。羅格列酮組以羅格列酮3mg/kg/d灌胃給藥，持續(xù)二個(gè)月。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由按原來(lái)配方進(jìn)食，常規(guī)飲水，不使用胰島素及其他降糖藥，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。每組大鼠均于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、結(jié)束時(shí)稱(chēng)量體重、取血。大鼠自試驗(yàn)前一日20：00起禁食，試驗(yàn)日8：00分別自內(nèi)眥靜脈采血3ml,分離血清，保存于-20℃冰箱，用于各指標(biāo)的檢測(cè)(測(cè)定指標(biāo)時(shí)均使用同一批試劑盒)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，留取大鼠胸主動(dòng)脈部分用1％的戊二醛固

7、定，待做電鏡，其余部分以4％中性多聚甲醛固定，待組織學(xué)檢查。 1血糖、胰島素的測(cè)定：血糖用葡萄糖氧化酶法測(cè)定；胰島素用放射免疫法測(cè)定。采用穩(wěn)態(tài)模型(HomeoestasisModelAssessment，HOMA)及胰島素敏感指數(shù)(InsulinSensitivityIndex，ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度； 2血脂：甘油三脂(triglyceride，TG)、總膽固醇(totalcholesterole，TC)、高密度

8、脂蛋白膽固醇(highdensitylipoprotein-cholesterole，HDL-C)比色法測(cè)定，低密度脂蛋白膽固醇(lowerdensitylipoprotein-cholesterole,LDL-C)由Friedewald公式(LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2)求出(以mmol/L計(jì))。Cu+比色法測(cè)定游離脂肪酸(FFA)含量。 3炎癥相關(guān)因子測(cè)定：免疫沉淀法測(cè)定C反應(yīng)蛋白(CRP)的含量。 4

9、胸主動(dòng)脈細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查：常規(guī)方法制備大鼠胸主動(dòng)脈光鏡及電鏡組織切片，行HE及MMP-9、TIMP-1免疫組化染色。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢驗(yàn)的顯著性用P值表示。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果：1體重：實(shí)驗(yàn)初，大鼠隨機(jī)分組，各組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，具有可比

10、性。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，模型組體重(502.7±42.9g)明顯高于在正常對(duì)照組(432.2±23.9g)，有顯著性差異(P＜0.01)。羅格列酮干預(yù)組(438.9±24.2g)與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，但明顯低于模型組(P＜0.01)。 2血糖和胰島素：STZ造模前各組大鼠空腹血糖無(wú)差別。腹腔注射STZ后，模型組血糖(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)明顯高于正常組，有顯著性差異(P＜0.01)。羅格列酮干預(yù)組血糖和正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，血糖低于模

11、型組(P＜0.01)。羅格列酮干預(yù)組胰島素與正常組相比無(wú)顯著性差異。 3血脂：STZ造模后模型組大鼠的TC、TG、LDL、及FFA均明顯升高，與正常組相比有顯著性差異。HDL降低，與正常組相比有顯著性差異差異。羅格列酮干預(yù)組的FFA比模型組明顯降低，但仍高于正常組。 4各組血清CRP含量的變化：模型組CRP水平(5.5±1.0)較正常對(duì)照組(2.7±0.6)及羅格列酮干預(yù)組(3.3±1.1)顯著升高(P＜0.01)；羅格

12、列酮干預(yù)組(3.3±1.1)較正常對(duì)照組(2.7±0.6)顯著升高(P＜0.01)。 5免疫組化胸主動(dòng)脈內(nèi)皮MMP-9表達(dá)水平：模型組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮MMP-9表達(dá)水平(0.397±0.025)較正常對(duì)照組(0.233±0.038)及羅格列酮干預(yù)組(0.326±0.038)顯著升高(P＜0.01)；羅格列酮干預(yù)組(0.326±0.038)較正常對(duì)照組(0.233±0.038)顯著升高(P＜0.01)。 6免疫組化胸主動(dòng)脈內(nèi)皮

13、TIMP-1表達(dá)水平：模型組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮TIMP-1表達(dá)水平(0.231±0.030)較正常對(duì)照組(0.405±0.027)及羅格列酮干預(yù)組(0.339±0.033)顯著升高(P＜0.01)；羅格列酮干預(yù)組(0.339±0.033)較正常對(duì)照組(0.405±0.027)顯著升高(P＜0.01)。 7胸主動(dòng)脈病理形態(tài)改變：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血管內(nèi)膜明顯增厚。羅格列酮治療組血管內(nèi)膜輕度增厚，較模型組血管內(nèi)膜病變明顯減輕。電鏡

14、下主動(dòng)脈內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)顯示，模型組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞膜嚴(yán)重融合、脫落，線粒體的嵴和膜嚴(yán)重融合、消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有嚴(yán)重脫顆?，F(xiàn)象，吞飲小泡數(shù)量明顯減少。羅格列酮干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞膜部分融合，線粒體的嵴和膜輕度融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)脫顆?，F(xiàn)象，吞飲小泡數(shù)量減少，較模型組有顯著性差異。 結(jié)論：1炎癥因子CRP、MMP-9、TIMP-1是2型糖尿病血管病變發(fā)生的重要影響因素，進(jìn)一步證明T2DM血管病變是一種慢性炎性疾病。 2RSG