糖尿病大鼠肺臟AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1的表達及人工蟲草和羅格列酮對肺的保護作用.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是多種病因引起的以慢性高血糖為主要特征,導致多組織系統(tǒng)病變的代謝紊亂綜合征。肺臟作為糖尿病損害的靶器官之一,其損害主要表現(xiàn)為肺通氣功能障礙、彌散功能障礙、基底膜增厚、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成和/或降解代謝失衡,肺間質(zhì)增厚,最終導致肺纖維化的發(fā)生。目前糖尿病肺纖維化的發(fā)病機制尚未明確。持續(xù)高血糖引起的蛋白質(zhì)非酶糖基化可形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(

2、advanced glycation end products,AGEs),AGEs與其受體(receptor of advanced glycation end products,RAGEs)結合可啟動細胞內(nèi)信號轉導途徑,激活一系列細胞介導反應,導致細胞因子和生長因子生成和釋放,引起組織修復和蛋白變性。轉化生長因子-β1(transforming growthfactor-β1 TGF-β1)參與細胞生長、增殖、分化和移行,介導細胞凋

3、亡,調(diào)節(jié)ECM的代謝。在多種促纖維化細胞因子中,TGF-β1被公認為是與肺纖維化發(fā)生發(fā)展關系最為密切的因子之一?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)及其抑制物(inhibitor of matrixmetalloproteinases,TIMPs)在ECM代謝中起重要作用,明膠酶B(MMP-9)主要降解彈性蛋白、Ⅳ膠原、LM基膜等ECM成分,導致肺基膜及結構支架受損。TIMP-1可抑制MMP-9的

4、活性而影響ECM的降解,MMP-9和TIMP-1的表達及活性改變可能參與了糖尿病肺纖維化的病變過程。冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc是麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體,是一種名貴中藥材,具有滋肺補腎、止血化痰、保肺、止癆嗽有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能等多種功效。羅格列酮(rosiglitaazone,RSG)是噻唑烷二酮類胰島素增敏劑,通過激活過氧化物酶體增殖活化受體γ(peroxis

5、ome pmlifemtors activated receptor,PPARγ)發(fā)揮調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應等作用,PPARγ介導的信號能負反饋調(diào)節(jié)T細胞、巨噬細胞及有關免疫調(diào)節(jié)細胞的活化、增生及炎癥反應基因的轉錄,因而在抑制肺間質(zhì)組織局部炎癥和纖維化中可能發(fā)揮重要作用。
　　 一次性大劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射建立1型糖尿病大鼠模型,給予人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉和羅格列酮進行干預,并應

6、用HE染色、Masson染色、免疫組織化學法、RT-PCR等方法觀察肺組織形態(tài)的改變和AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1在肺組織表達的情況,探討AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1在糖尿病肺纖維化病變過程中的作用和人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉及羅格列酮對肺臟的保護作用。
　　 方法:
　　 將60只8周齡雄性SD大鼠分為正常對照組和實驗組,隨機抽取其中的15只大鼠作為正常對照組(A組),剩余的45只則

7、作為實驗組。對實驗組大鼠進行鏈脲佐菌素腹腔注射(55mg/kg),72小時后取尾靜脈血測定血糖大于16.7mmol/L,并持續(xù)3天,為1型糖尿病大鼠模型造模成功。將45只糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組(B組)、人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉(2.4g/kg/d)干預組(C組),羅格列酮(4mg/kg/d)干預組(D組)。實驗共持續(xù)12周,在造模前及成膜后0、4、8、12周末測定大鼠血糖、體重和12周末24小時尿量;于第12周末股動脈放血處死動物

8、,取出糖尿病大鼠雙側肺臟,右側肺組織制備光鏡切片,運用HE,Masson染色觀察肺臟形態(tài)學改變及膠原纖維分布情況;應用免疫組化方法檢測AGEs,TGF-β1在肺組織的表達部位及水平;左側肺組織應用RT-PCR方法檢測MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表達情況。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗結果,符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù),多組間比較采用方差分析,組間比較采用LSD檢驗。
　　 結果:
　　 1：造模7

9、2小時候后,實驗第4周、8周和12周末,B、C和D組較A組大鼠血糖明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。實驗第4周、8周和12周末,B、C和D組較A組大鼠體重明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。
　　 2：HE、Masson染色結果顯示,與A組相比,B組可見肺泡壁增厚,肺泡間隔明顯增寬,大量炎細胞浸潤,肺間質(zhì)中成纖維細胞明顯增多,膠原纖維沉積,肺泡結構破壞,部分肺泡腔出現(xiàn)萎縮、塌陷;一些肺泡毛細血管出現(xiàn)縮窄

10、、扭曲甚至閉塞。C組和D組較B組有所改善。
　　 3：免疫組化分析結果顯示,與A組比較,B、C和D組AGEs,TGF-β1表達明顯升高,差異具有顯著性(P均＜0.01);與B組比較,C組和D組表達水平有所降低,差異具有顯著性(P均＜0.01)。
　　 4：RT-PCR反應結果顯示,B、C和D組MMP-9 mRNA表達較A組降低,TIMP-1 mRNA表達較A組升高(P均＜0.01);C組和D組MMP-9 mRNA表達較B

11、組上調(diào),TIMP-1 mRNA表達較B組降低,且差異具有顯著性(P均＜0.01)。
　　 結論:
　　 1：一次性腹腔注射大劑量STZ,破壞大鼠胰島β細胞,可建立以血糖升高、尿量增加、體重下降為特征的1型糖尿病大鼠模型。此模型與人類1型糖尿病特征類似。
　　 2：糖尿病大鼠肺組織形態(tài)結構改變符合肺纖維化的病理變化,肺組織AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1表達水平異常,提示其可能參與了糖尿病肺纖維化的