靶向RNA干擾骨橋蛋白基因?qū)Υ笫笱芷交〖毎鲋?、凋亡的影?pdf

1、血管平滑肌細胞(VSMCs)是血管壁細胞的主要成分,維系著血管壁的結(jié)構(gòu)和功能。VSMCs的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為的改變被認為是冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)后再狹窄(RS)形成的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。骨橋蛋白(OPN)是細胞外基質(zhì)中一種重要的功能蛋白,是VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志,參與VSMCs的增殖分化、凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié),被認為是血管損傷修復(fù)過程中的始動因素。作為一種基因治療方法,RNA干擾(RNAi)以其特異性、高效性

2、成為研究的熱點。慢病毒載體是基因治療的理想載體,具有可感染分裂及非分裂細胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點。為此,利用RNAi技術(shù),設(shè)計并合成針對大鼠OPN基因的小干擾RNA(siRNA)片段,通過慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs,觀察其對VSMCs的增殖及凋亡的影響,以期為進一步研究OPN功能及基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 本課題分為兩部分。
　　 第一部分:骨橋蛋白特異性siRNA慢病毒載體的構(gòu)

3、建與鑒定。從Genebank獲得OPN基因序列,根據(jù)OPN mRNA序列,設(shè)計、合成三對大鼠OPN基因RNAi片段。磷酸化后退火,插入pLKO.1 scramble shRNA載體,構(gòu)建能表達小發(fā)夾RNA(small hair,shRNA)的pLKO.1 scramble shRNA-OPN質(zhì)粒載體,分別命名為pLKO.1 scrambleshRNA-OPN1、pLKO.1 scramble shRNA-OPN2、pLKO.1 scra

4、mble shRNA-OPN3,送生物公司測序鑒定。利用原代培養(yǎng)的VSMCs檢測干擾效率,將干擾效率最高的重組質(zhì)粒載體用于病毒包裝。將pLKO.1 scramble shRNA-OPN、psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝產(chǎn)生慢病毒。結(jié)果顯示:pLKO.1 scramble shRNA-OPN2為干擾效率最高的質(zhì)粒。靶向大鼠OPN基因的RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功,滴度滿足實驗需要。
　　 第二部分:靶向大鼠OPN基

5、因的RNAi慢病毒載體對血管平滑肌細胞增殖、凋亡的影響。以構(gòu)建好的慢病毒載體感染VSMCs,使用Trizol抽提細胞總RNA,以反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測VSMCs OPN mRNA表達水平;蛋白免疫印記法(WB)檢測VSMCs OPN蛋白表達水平;通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測VSMCs細胞增殖;流式細胞儀(FCM)檢測VSMCs凋亡。結(jié)果顯示:重組慢病毒感染后可顯著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表達水平,并可