花刺參粘多糖及其復方制劑對血管平滑肌細胞粘附分子表達的影響.pdf

1、目的 觀察花刺參粘多糖及其復方制劑對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)表達血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)和細胞間粘附分子-1(ICAM-1)以及其與單核細胞粘附的影響，從細胞學和分子生物學水平進一步探討花刺參粘多糖及其復方抗動脈粥樣硬化和再狹窄的可能機制。 方法 組織貼塊法體外原代培養(yǎng)雄性Wistar大鼠胸主動脈平滑肌細胞，取生長穩(wěn)定的3-8代細胞用于實驗。將細胞按相同的密度

2、接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，待其生長約90％融合時，換含0.5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，使細胞饑餓24h達到同步化，然后再換含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，取生長良好的VSMC隨機分為下列各組(每組3個樣本)：空白對照組、TNF-α刺激組(10ng/mL)、TNF-α+花刺參粘多糖組(分別含花刺參粘多糖1.5mg/ml、3.0mg/ml、6.0mg/ml)及TNF-α+復方花刺參粘多糖組(分別含復方花刺參粘多糖提取物3mg/ml、

3、6mg/ml、12mg/ml)，空白對照組未加任何干預因素。繼續(xù)孵育一定時間后，分別采用流式細胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α誘導的VSMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1蛋白及mRNA水平的表達，用細胞粘附實驗觀察花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α誘導的VSMC與單核細胞粘附的影響。所有的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件作統(tǒng)計學處理。 結(jié)果 1.花刺參粘多糖及其復

4、方制劑對TNF-α誘導的VSMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1蛋白水平表達的影響 (1).花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α誘導VSMC的VCAM-1蛋白水平表達的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胸主動脈SMC的VCAM-1呈低水平表達(平均熒光強度為35.4±2.3)，加入10ng/mLTNF-α孵育24h后，可顯著誘導大鼠SMC高表達粘附分子VCAM-1(平均熒光強度升為176.4±3.5)，與空白

5、對照組比較P＜0.01?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組均可明顯抑制TNF-α誘導的VSMC表達VCAM-1(平均熒光強度分別降為132.1±2.0、99.6±2.5、80.7±1.9)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，且其抑制作用具有濃度依賴性。復方花刺參粘多糖三個不同劑量組亦均可抑制TNF-α誘導的VSMC表達VCAM-1(平均熒光強度分別降為144.0±6.3、105.1±6.4、89.3±3.1)，與TNF-α刺激組比較P＜0.0

6、1，且其抑制作用具有濃度依賴性。 (2).花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α誘導VSMC的ICAM-1蛋白水平表達的影響 空白對照組大鼠胸主動脈SMC微弱表達ICAM-1(平均熒光強度為33.9±1.7)，加入10ng/mLTNF-α孵育24h后，可顯著誘導大鼠SMC高表達粘附分子ICAM-1(平均熒光強度升為92.2±2.9)，與空白對照組比較P＜0.01?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組均可明顯抑制TNF-α誘導的VSM

7、C表達ICAM-1(平均熒光強度分別降為71.5±1.6、66.2±1.1、58.3±2.1，)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，且其抑制作用具有濃度依賴性。復方花刺參粘多糖三個不同劑量組亦均可抑制TNF-α誘導的VSMC表達ICAM-1(平均熒光強度分別降為88.1±3.3、72.3±5.6、63.3±2.6)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，且其抑制作用具有濃度依賴性。 2.花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α刺激的

8、VSMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1mRNA水平表達的影響 (1).花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α刺激VSMC的VCAM-1mRNA水平表達的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胸主動脈SMC弱表達VCAM-1(相對光密度比值為0.30±0.02)，加入10ng/mlTNF-α孵育VSMC12小時后，VCAM-1mRNA表達顯著增強(相對光密度比值升為0.61±0.03)，與空白對照組比較P＜0.0

9、1?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組皆對TNF-α誘導的VCAM-1mRNA表達有明顯抑制作用(相對光密度比值分別降為0.49±0.03、0.46±0.03、0.41±0.04)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，且其抑制作用具有濃度依賴性。復方花刺參粘多糖三個不同劑量組亦均可抑制TNF-α誘導的VCAM-1mRNA表達(相對光密度比值分別降為0.53±0.03、0.50±0.04、0.44±0.02)，與TNF-α刺激組比較P＜0.01，

10、且其抑制作用具有濃度依賴性。 (2).花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α刺激VSMC的ICAM-1mRNA水平表達的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胸主動脈SMC弱表達ICAM-1(相對光密度比值為0.25±0.02)，加入10ng/mlTNF-α孵育12小時后，ICAM-1mRNA表達顯著增強(相對光密度比值升為0.41±0.03)，與空白對照組比較P＜0.01?；ù虆⒄扯嗵侨齻€不同濃度組均可明顯抑制T

11、NF-α誘導ICAM-1mRNA水平的表達(相對光密度比值分別降為0.37±0.02、0.35±0.01、0.30±0.03)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，且其抑制作用具有濃度依賴性。小劑量復方花刺參粘多糖(3mg/ml)對TNF-α誘導的ICAM-1mRNA表達有減弱趨勢(相對光密度比值為0.39±0.03)，但未達統(tǒng)計學意義，中、大劑量組(6mg/ml、12mg/ml)可明顯抑制TNF-α誘導的ICAM-1mRNA表達(相對

12、光密度比值分別降為0.37±0.02、0.32±0.01)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，隨著劑量的增加，其抑制作用逐漸增強。 3.花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α刺激的VSMC與單核細胞粘附的影響 粘附實驗結(jié)果顯示，空白對照組中只有少量單核細胞與VSMC粘附(OD值為0.148±0.032)，在10ng/mlTNF-α孵育24h后，VSMC與單核細胞粘附作用顯著增強(OD值升為0.467±0.062)，與空白

13、對照組比較P＜0.01。實驗中發(fā)現(xiàn)不同濃度的花刺參粘多糖均可明顯抑制TNF-α誘導的VSMC與單核細胞的粘附能力(OD值分別降為0.383±0.052、0.327±0.029、0.256±0.029)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，且其對細胞粘附的抑制作用具有濃度依賴性。復方花刺參粘多糖小劑量組對TNF-α誘導的VSMC與單核細胞粘附作用有減弱趨勢(OD值為0.427±0.026)，但未達統(tǒng)計學差異，中、大劑量組均可抑制TNF-α

14、誘導的VSMC與單核細胞的粘附(OD值分別為0.402±0.016、0.347±0.030)，與TNF-α刺激組比較P＜0.05，隨著其劑量增加，對細胞粘附的抑制作用增強。 結(jié)論 1.正常情況下，體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈SMC經(jīng)傳代后可有一定量的粘附分子VCAM-1和ICAM-1表達，但表達量很低，炎癥因子TNF-α可顯著誘導VSMC表達VCAM-1和ICAM-1，并明顯促進其與單核細胞的粘附。 2.花刺參粘多糖及

15、其復方制劑對TNF-α誘導的大鼠胸主動脈SMC粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達具有濃度依賴性抑制作用。 3.花刺參粘多糖及其復方制劑對TNF-α誘導的VSMC與單核細胞的粘附能力有明顯抑制作用，且其抑制作用具有濃度依賴性。 4.粘附分子VCAM-1和ICAM-1在介導SMC和單核細胞的粘附上起著重要作用，花刺參粘多糖及其復方制劑抑制單核細胞和VSMC的粘附與抑制VSMC上VCAM-1、ICAM-1的表達具有相關(guān)性