ORC1基因RNA干擾對大鼠血管平滑肌細胞表型的影響.pdf

1、研究背景和目的： 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis As)所造成的冠心病、腦卒中等各種血管并發(fā)癥是世界各國的首要致死和致殘原因，現(xiàn)代細胞和分子生物學技術顯示動脈粥樣硬化病變具有巨噬細胞游移、平滑肌細胞增生；大量膠原纖維、彈力纖維和蛋白多糖等結綈組織形成；以及細胞內(nèi)、外脂質積聚的特點。血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecell，VSMCs)是血管壁的主要組成部分，VSMCs的異常增殖是動脈粥樣

2、硬化、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術后(Percutaneous Coronary Interevention PCI)再狹窄等血管疾病的主要病理基礎。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells VSMCs)分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)兩種表型。收縮表型屬于成熟類型，分化程度高。合成表型屬于不成熟類型，分化程度低。VSMCs表型轉化是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成型術后再狹窄等心血管病VSMCs

3、增殖和遷移的關鍵性起始步驟。收縮型主要標志物有：α平滑肌肌動蛋白(α-SMactin)，平滑肌肌球蛋白重鏈2(SM-2)，Calponin及vimentin等。合成型主要標志物有：基質Gla蛋白和骨橋蛋白(osteopontin)。起始識別復合物(Origin recognition complex，ORC)是真核細胞DNA復制起始蛋白，與染色體上的多種復制啟動因子協(xié)同作用，參與DNA復制的啟動，它由6個亞基組成。當ORC與DNA的復制

4、起始位點特異結合后，形成一個平臺，之后cdc6、Cdt1及MCM2-7相繼結合到ORC上，形成復制前復合物。復制前復合物在多種蛋白和激酶的作用下活化，促進細胞由G1期進入S期，逐步完成DNA的復制。在芽殖酵母，ORC在整個細胞周期中始終結合在起始點上；在哺乳動物細胞中，ORC2-6在細胞周期各階段均與染色體結合，而ORC1在S期卻從核酸上解離下來，直到下一個細胞周期的G1期才重新結合到染色體上。RNA干擾(RNA interfering

5、，RNAi)作為一種新型的研究基因功能、進行基因治療的工具，它具有高效、高特異性的特點。ORCI與細胞增殖密切相關，通過在細胞核內(nèi)與ORC2-5核心復合物迅速的結合或解離，嚴格控制細胞周期進程，是啟動真核細胞DNA復制的關鍵因子，基于這一認識，本課題前期研究通過脂質體介導siRNA轉染大鼠VSMCs，對大鼠ORC1基因表達進行RNA干擾，觀察其對大鼠VSMCs細胞增殖及細胞周期的影響，證實ORC1基因RNA干擾能抑制血清刺激引起的VSM

6、Cs增殖，但是，細胞增殖能力抑制后，作為細胞表型標志物的蛋白如何變化，細胞形態(tài)能否向收縮形態(tài)轉變，細胞表型是否發(fā)生改變，尚未進行研究。本實驗利用脂質體介導的siRNA抑制ORC1基因的表達，檢測VSMCs的形態(tài)結構及表型標志物表達量是否改變，探討ORC1基因抑制后VSMCs的表型轉化，旨在為血管損傷性疾病的防治提供新的思路。 研究方法： 1.用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，作為對ORC1進RNA干擾、觀察其在細

7、胞增殖、細胞表型變化的實驗平臺；倒置顯微鏡下形態(tài)學觀察，免疫熒光法檢測α-SM-actin以鑒定VSMCs。 2.使用陽性脂質體Lipofectamine2000對VSMCs進行siRNA轉染；通過Westernblot技術檢測RNA干擾對ORC1基因的抑制效果。 3.通過MTT試驗，檢測特異性抑制ORC1基因對大鼠VSMCs增殖能力影響。 4.ORC1基因RNA干擾對大鼠VSMCs細胞表型影響的檢測：免疫熒光染

8、色后激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)結構；應用流式細胞儀及Western blot技術檢測細胞表型標志蛋白表達量的變化。 研究結果： 1.本實驗利用組織塊貼壁法成功地在體外培養(yǎng)了大鼠VSMCs，并經(jīng)形態(tài)及免疫熒光細胞化學證實，為進一步實驗建立了平臺； 2.以特異性陽性siRNA轉染VSMCs，經(jīng)Western blot證實能顯著抑制ORC1基因的蛋白表達，為進一步試驗建立了平臺。 3.ORC1基因RNA干擾后

9、，正常對照組、陰性轉染組及陽性轉染組的MTT吸光度值分別為0.1787±0.0412、0.1819±0.0386和0.1065±0.0257，陽性轉染組與正常對照組及陰性轉染組相比，MTT吸光度值顯著下降(p<0.01)，正常對照組與陰性轉染組MTT吸光度值無顯著差異，陽性轉染組VSMCs增殖能力顯著下降。 4. ORC1基因RNA干擾后，陽性轉染組細胞呈現(xiàn)收縮型形態(tài)特征，正常對照組及陰性轉染組細胞呈現(xiàn)合成型形態(tài)特征：經(jīng)流式細胞

10、儀及Western blot技術檢測，VSMCs收縮型標志物α平滑肌肌動蛋白(α-SMactin)和平滑肌肌球蛋白重鏈2(SM-2)表達水平明顯升高，合成型標志物骨橋蛋白(Osteopontin)表達水平明顯降低，正常對照組及陰性轉染組間三種標志物表達水平無顯著差異。 研究結論： 1.ORC1基因與VSMCs增殖能力密切相關，抑制ORC1的表達可顯著抑制VSMCs的增殖。 2.RNA干擾介導的ORC1基因沉寂可促