ORC1基因RNA干擾對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型的影響.pdf

1、研究背景和目的： 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis As)所造成的冠心病、腦卒中等各種血管并發(fā)癥是世界各國(guó)的首要致死和致殘?jiān)颍F(xiàn)代細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)顯示動(dòng)脈粥樣硬化病變具有巨噬細(xì)胞游移、平滑肌細(xì)胞增生；大量膠原纖維、彈力纖維和蛋白多糖等結(jié)綈組織形成；以及細(xì)胞內(nèi)、外脂質(zhì)積聚的特點(diǎn)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musclecell，VSMCs)是血管壁的主要組成部分，VSMCs的異常增殖是動(dòng)脈粥樣

2、硬化、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后(Percutaneous Coronary Interevention PCI)再狹窄等血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells VSMCs)分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)兩種表型。收縮表型屬于成熟類(lèi)型，分化程度高。合成表型屬于不成熟類(lèi)型，分化程度低。VSMCs表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成型術(shù)后再狹窄等心血管病VSMCs

3、增殖和遷移的關(guān)鍵性起始步驟。收縮型主要標(biāo)志物有：α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMactin)，平滑肌肌球蛋白重鏈2(SM-2)，Calponin及vimentin等。合成型主要標(biāo)志物有：基質(zhì)Gla蛋白和骨橋蛋白(osteopontin)。起始識(shí)別復(fù)合物(Origin recognition complex，ORC)是真核細(xì)胞DNA復(fù)制起始蛋白，與染色體上的多種復(fù)制啟動(dòng)因子協(xié)同作用，參與DNA復(fù)制的啟動(dòng)，它由6個(gè)亞基組成。當(dāng)ORC與DNA的復(fù)制

4、起始位點(diǎn)特異結(jié)合后，形成一個(gè)平臺(tái)，之后cdc6、Cdt1及MCM2-7相繼結(jié)合到ORC上，形成復(fù)制前復(fù)合物。復(fù)制前復(fù)合物在多種蛋白和激酶的作用下活化，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，逐步完成DNA的復(fù)制。在芽殖酵母，ORC在整個(gè)細(xì)胞周期中始終結(jié)合在起始點(diǎn)上；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ORC2-6在細(xì)胞周期各階段均與染色體結(jié)合，而ORC1在S期卻從核酸上解離下來(lái)，直到下一個(gè)細(xì)胞周期的G1期才重新結(jié)合到染色體上。RNA干擾(RNA interfering

5、，RNAi)作為一種新型的研究基因功能、進(jìn)行基因治療的工具，它具有高效、高特異性的特點(diǎn)。ORCI與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，通過(guò)在細(xì)胞核內(nèi)與ORC2-5核心復(fù)合物迅速的結(jié)合或解離，嚴(yán)格控制細(xì)胞周期進(jìn)程，是啟動(dòng)真核細(xì)胞DNA復(fù)制的關(guān)鍵因子，基于這一認(rèn)識(shí)，本課題前期研究通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染大鼠VSMCs，對(duì)大鼠ORC1基因表達(dá)進(jìn)行RNA干擾，觀察其對(duì)大鼠VSMCs細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，證實(shí)ORC1基因RNA干擾能抑制血清刺激引起的VSM

6、Cs增殖，但是，細(xì)胞增殖能力抑制后，作為細(xì)胞表型標(biāo)志物的蛋白如何變化，細(xì)胞形態(tài)能否向收縮形態(tài)轉(zhuǎn)變，細(xì)胞表型是否發(fā)生改變，尚未進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA抑制ORC1基因的表達(dá)，檢測(cè)VSMCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)及表型標(biāo)志物表達(dá)量是否改變，探討ORC1基因抑制后VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，旨在為血管損傷性疾病的防治提供新的思路。 研究方法： 1.用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，作為對(duì)ORC1進(jìn)RNA干擾、觀察其在細(xì)

7、胞增殖、細(xì)胞表型變化的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)；倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，免疫熒光法檢測(cè)α-SM-actin以鑒定VSMCs。 2.使用陽(yáng)性脂質(zhì)體Lipofectamine2000對(duì)VSMCs進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染；通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)RNA干擾對(duì)ORC1基因的抑制效果。 3.通過(guò)MTT試驗(yàn)，檢測(cè)特異性抑制ORC1基因?qū)Υ笫骎SMCs增殖能力影響。 4.ORC1基因RNA干擾對(duì)大鼠VSMCs細(xì)胞表型影響的檢測(cè)：免疫熒光染

8、色后激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀及Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志蛋白表達(dá)量的變化。 研究結(jié)果： 1.本實(shí)驗(yàn)利用組織塊貼壁法成功地在體外培養(yǎng)了大鼠VSMCs，并經(jīng)形態(tài)及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)證實(shí)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)建立了平臺(tái)； 2.以特異性陽(yáng)性siRNA轉(zhuǎn)染VSMCs，經(jīng)Western blot證實(shí)能顯著抑制ORC1基因的蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步試驗(yàn)建立了平臺(tái)。 3.ORC1基因RNA干擾后

9、，正常對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組及陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組的MTT吸光度值分別為0.1787±0.0412、0.1819±0.0386和0.1065±0.0257，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組與正常對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組相比，MTT吸光度值顯著下降(p<0.01)，正常對(duì)照組與陰性轉(zhuǎn)染組MTT吸光度值無(wú)顯著差異，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組VSMCs增殖能力顯著下降。 4. ORC1基因RNA干擾后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞呈現(xiàn)收縮型形態(tài)特征，正常對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞呈現(xiàn)合成型形態(tài)特征：經(jīng)流式細(xì)胞

10、儀及Western blot技術(shù)檢測(cè)，VSMCs收縮型標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMactin)和平滑肌肌球蛋白重鏈2(SM-2)表達(dá)水平明顯升高，合成型標(biāo)志物骨橋蛋白(Osteopontin)表達(dá)水平明顯降低，正常對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組間三種標(biāo)志物表達(dá)水平無(wú)顯著差異。 研究結(jié)論： 1.ORC1基因與VSMCs增殖能力密切相關(guān)，抑制ORC1的表達(dá)可顯著抑制VSMCs的增殖。 2.RNA干擾介導(dǎo)的ORC1基因沉寂可促