惡性黑素瘤VEGF和eNOS的表達(dá)以及VEGF-siRNA對(duì)其生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:惡性黑素瘤VEGF和eNOS的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系 目的:研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)，以及與惡性黑素瘤血管生成的關(guān)系，探討eNOS產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在介導(dǎo)VEGF促腫瘤血管生成中的作用機(jī)制。 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)31例惡性黑素瘤組織eNOS、VEGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)的表達(dá)，依據(jù)FⅧRAg的表達(dá)評(píng)

2、價(jià)腫瘤微血管密度(MVD)，并且以30例色素痣組織作為對(duì)照研究。 結(jié)果:①在31例惡性黑素瘤組織中，24例表達(dá)eNOS，26例表達(dá)VEGF，而在色素痣組織未檢測(cè)到eNOS和VEGF的表達(dá)；②在惡性黑素瘤組織中，VEGF與eNOS的表達(dá)呈正相關(guān)；③在惡性黑素瘤組織中，eNOS、VEGF的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)，且惡性黑素瘤MVD明顯高于色素痣；④在惡性黑素瘤組織中eNOS、VEGF表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。 結(jié)論:①VEGF和e

3、NOS可作為區(qū)別良、惡性黑素細(xì)胞腫瘤的重要指標(biāo)；②在惡性黑素瘤中MVD隨著VEGF和eNOS表達(dá)的增強(qiáng)而增加，提示兩者可促進(jìn)惡性黑素瘤血管生成；③eNOS在VEGF調(diào)節(jié)腫瘤血管生成中可能具有重要作用。 第二部分:VEGF的表達(dá)對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制 目的:觀察VEGF表達(dá)對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞增殖的影響，以及一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)在其中所起的作用，以探討VEGF促進(jìn)惡性黑素瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

4、 方法:通過(guò)電穿孔法將VEGF165cDNA和空載體分別轉(zhuǎn)染至惡性黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中，并設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)上述處理的A375細(xì)胞體外增殖效應(yīng)及其分泌的VEGF含量，蛋白印跡(WesternBlot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述處理細(xì)胞合成的誘導(dǎo)型、內(nèi)皮型、神經(jīng)型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS、nNOS)的蛋白表達(dá)，用硝酸還原酶法檢測(cè)上述處理細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量，MTT法檢測(cè)一氧化氮

5、合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對(duì)轉(zhuǎn)染VEGF165cDNA后A375細(xì)胞的增殖影響。 結(jié)果:與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染VEGFi65cDNA的A375細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后72h、96h其VEGF的分泌明顯增加(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h其iNOS蛋白的合成和NO的釋放明顯升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，但在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均未檢測(cè)到eNOS和nNOS蛋白表

6、達(dá)，L-NAME對(duì)轉(zhuǎn)染VEGF165cDNA72h后的A375細(xì)胞增殖具有抑制作用，并顯示劑量依賴性(P＜O.01)。 結(jié)論:內(nèi)源性VEGF可能通過(guò)自分泌方式促進(jìn)A375細(xì)胞增殖，其促進(jìn)A375細(xì)胞增殖作用可能與iNOS產(chǎn)生的NO密切相關(guān)。 第三部分:pU-VEGF-siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建針對(duì)VEGF的發(fā)卡樣siRNA真核表達(dá)載體pU-VEGF-siRNA，并導(dǎo)入惡性黑素瘤細(xì)胞，探討其在體外培

7、養(yǎng)惡性黑素瘤細(xì)胞中對(duì)VEGF的干擾作用。 方法:人工合成一對(duì)互補(bǔ)并編碼相應(yīng)短發(fā)夾狀VEGF-siRNA的寡核苷酸鏈，將其插入到pSilencerTM2.1-U6neo載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定所構(gòu)建的重組體是否正確；采用電轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建重組體導(dǎo)入人惡性黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LOVO細(xì)胞中，用G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)VEGF-siRNA的細(xì)胞；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、ELISA分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞VEGFmRN

8、A和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果經(jīng)測(cè)序證明pU-VEGF-siRNA序列正確；G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)VEGF-siRNA的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA載體后，A375和LOVO細(xì)胞VEGFmRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯下降(P＜O.01)。 結(jié)論:L測(cè)序結(jié)果表明發(fā)卡樣的VEGF-siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染A375和LOVO細(xì)胞后獲得穩(wěn)定表達(dá)，并可特異性封閉VEGF的表達(dá)，為進(jìn)一步研究pU-VEGF-siRNA載體在

9、惡性黑素瘤治療中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第四部分:pU-VEGF-siRNA對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究pU-VEGF-siRNA體外對(duì)A375和LOVO細(xì)胞的增殖和凋亡，及其體內(nèi)對(duì)惡性黑素瘤成瘤和凋亡的影響，以期為臨床惡性黑素瘤的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法:采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組A375和LOVO細(xì)胞增殖，并將含實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組A375細(xì)胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)人靜脈內(nèi)

10、皮細(xì)胞(ECV-304)，觀察ECV-304生長(zhǎng)情況；用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA載體的A375細(xì)胞凋亡；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織VEGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)的表達(dá)，依據(jù)FⅧRAg的表達(dá)評(píng)價(jià)腫瘤微血管密度(MVD)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)定量檢測(cè)pU-VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞裸鼠模型的腫瘤組織凋亡。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組A375細(xì)胞增殖較對(duì)照組明

11、顯減慢(P＜0.01)，其細(xì)胞周期出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，而LOVO細(xì)胞的增殖與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，對(duì)照組A375細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)ECV-304細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，而實(shí)驗(yàn)組A375細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)其促增殖作用顯著降低(P＜0.01)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)驗(yàn)組成瘤率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，且其腫瘤生長(zhǎng)速度也明顯減慢(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)和MVD明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，對(duì)