siRNA抑制hTERT及VEGF表達治療鼻咽癌的實驗研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國最為常見的頭頸部惡性腫瘤，我國是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，而國內又以廣東、廣西、湖南、福建和江西南方 5 省發(fā)病率最高。鼻咽癌的原發(fā)部位深而隱蔽，不易觀察，與鼻腔、鼻竇及顱內毗鄰，出現(xiàn)的早期癥狀各異，轉移率高，易早期轉移，常常容易誤診或漏診，延誤治療。鼻咽癌的發(fā)病人群以30～50歲的青壯年多見，一旦發(fā)病，可對社會、經濟和家庭造成較大影響。因此，鼻咽癌早期診斷及治療的相關

2、研究一直是我國耳鼻咽喉科研工作的重點。 目前鼻咽癌的病因尚未完全明確，普遍認為其發(fā)病與EB病毒的感染、環(huán)境及遺傳因素有關。鼻咽癌的治療主要是以放射治療為主，對中晚期鼻咽癌患者、鼻咽癌放療后復發(fā)患者以及放療效果欠佳的患者，可采取化學藥物治療，但僅屬輔助性治療或姑息性治療。因受鼻咽腔部位隱蔽、腔道狹小、四周結構復雜、鼻咽癌低分化癌多見、易早期轉移、難以完整切除等特點的限制，鼻咽癌的手術治療僅僅在某些特殊情況下作為輔助方法采用。為了提

3、高鼻咽癌的治療效果，特別是為了解決對放療不敏感、放療后病灶殘留或放療后復發(fā)患者的治療難題，國內外研究者近年來相繼開展了各種生物治療研究，包括主動及被動免疫治療、基因治療、抗腫瘤血管生成治療、免疫調節(jié)劑和生物反應調節(jié)劑治療等，取得了一定的成果，但仍還不能達到臨床應用的水平，我們仍需要不斷努力，尋找更有效的治療手段。目前，依據(jù)腫瘤本身生物學特點及發(fā)生機制來制定基因治療方案已成為腫瘤治療的熱點，尤其是RNA干擾技術在哺乳動物體內的應用，為包括

4、鼻咽癌在內的腫瘤的基因治療開辟了一個新的領域。 端粒的長短與細胞壽命及增殖關系密切，端粒酶可以阻止端粒隨細胞分裂而逐漸縮短，從而穩(wěn)定染色體末端。端粒酶的激活可使細胞獲得永生，研究表明，端粒酶活性與惡性腫瘤關系密切。絕大部分惡性腫瘤細胞包括鼻咽癌細胞在內均可檢測到端粒酶的活性表達，而在正常組織和良性腫瘤端粒酶活性絕大部分為陰性，hTERT是端粒酶的活性亞單位，因此，hTERT基因是一個很好的鼻咽癌基因治療的靶基因。 血管內

5、皮因子VEGF是唯一能特異作用于內皮細胞的有絲分裂原，與鼻咽癌局部復發(fā)、淋巴結轉移、遠處轉移等有密切的聯(lián)系。絕大多數(shù)惡性腫瘤中均呈現(xiàn)VEGF及其受體的高表達。研究表明，VEGF的高表達與腫瘤患者生存期及轉移有關，即VEGF高表達者易轉移，生存期短。鼻咽癌患者中VEGF陽性高的病人，區(qū)域淋巴結轉移機會也高。目前利用VEGF基因開展抗腫瘤血管新生治療越來越受到研究者的重視，惡性腫瘤中VEGF及其受體的協(xié)同表達，旁/自分泌作用機制的確立也為腫

6、瘤的基因治療提供了新的靶點。抑制VEGF及其受體，阻斷VEGF與其受體相互作用，可以達到阻止腫瘤血管新生，抑制腫瘤生長轉移的目的，目前，鼻咽癌相關研究中VEGF與鼻咽癌的關系以及VEGF在鼻咽癌治療中的應用日益受到關注。 RNA 干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的研究生物體基因表達、調控與功能的新技術，它利用了由小干擾RNA引起的生物細胞內同源基因的特異性沉默現(xiàn)象，其本質是siRNA與對應的mRNA特異結合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。它普遍存在于各

7、種生物，是一種集經濟、快捷、高效、特異性強等特點于一體的抑制基因表達的技術手段，可廣泛用于基因功能測定及基因治療等方面。 本研究的目的是利用RNA干擾技術抑制hTERT基因和VEGF基因的表達，開展對鼻咽癌的基因治療研究。整個研究內容分三部分進行： 第一部分主要是siRNA的體外合成及鼻咽癌細胞內RNA干擾效應的觀察 目的:確定針對hTERT基因和VEGF基因進行RNA干擾的有效作用位點，觀察設計的sihTERT

8、和siVEGF在鼻咽癌中的RNA干擾效應，為后續(xù)的質粒構建和體內實驗奠定基礎。通過利用在線網站的生物軟件設計多個針對hTERT基因和VEGF基因的RNA干擾片段，利用體外轉錄法快速合成相應的siNRA，然后利用脂質體瞬時轉染到鼻咽癌CNE-2細胞中，通過熒光顯微鏡觀察、半定量RT-PCR、Western Blot、流式細胞學檢查及TRAP-銀染法觀察NRA干擾效應，確定RNA干擾最佳作用位點。 結果:確定了hTERT基因和VEG

9、F基因各2個有效作用位點，觀察到對hTERT基因和VEGF基因的有效RNA干擾可以將對應基因的mRNA水平分別下調89％～92％、80％～95％，同時使其表達的蛋白水平下降。對hTERT基因的有效干擾還可以使腫瘤細胞增殖受到抑制，使其細胞周期受阻于G<,0>～G<,1>期，誘導腫瘤細胞凋亡。 第二部分主要是針對第一部分確定的hTERT基因和VEGF基因RNA干擾的有效作用位點，設計并構建能在腫瘤細胞內表達siRNA的質粒載體。

10、 方法:利用pGenesil-1 Vector載體，分別構建針對hTER-T基因的RNA干擾質粒pGenesil-hTERT、針對VEGF基因的pGenesil-VEGF質粒、同時針對上述兩種基因的pGenesil-hTERT-VEGF質粒，然后將構建的質粒轉染CNE-2細胞，通過RF-PCR、Western Blot、MTT法來觀察RNA干擾效應， 結果:成功構建了pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF

11、及pGenesil-hTERT-VEGF質粒，觀察到上述質粒在CNE-2細胞可以表達siRNA，發(fā)揮RNA干擾效應。 第三部分主要是進行RNA干擾的裸鼠體內實驗，為今后的臨床實驗奠定基礎。 方法:是將裸鼠接種CNE-2細胞建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，然后利用pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF及pGenesil-hTERT-VEGF質粒分別進行siRNA治療鼻咽癌的基因治療，通過顯微鏡下形態(tài)學觀察、測

12、量腫瘤大小繪制腫瘤生長曲線、TUNEL法計算腫瘤細胞凋亡指數(shù)以及免疫組化等方法，觀察RNA干擾體內實驗的效果， 結果:發(fā)現(xiàn)3種質粒都能有效地抑制裸鼠移植瘤的生長，促進細胞的凋亡，而pGenesil-hTERT-VEGF質粒的RNAi效應要強于其他2個質粒載體。 結論： (1)體外轉錄合成的siRNA可在鼻咽癌中發(fā)揮特異性的RNA干擾效應；(2)hTERT基因的位點的335～357、2324～2346，VEGF基因

13、的1130～1152、1504～1526為RNA干擾的有效作用位點；(3)針對hTERST基因的有效RNA干擾可導致鼻咽癌腫瘤細胞生長緩慢，細胞增殖受抑，hTERT基因的mRNA水平下調，蛋白表達下降，端粒酶活性降低，細胞周期在G<,0>～G<,1>期受阻，并不同程度誘導細胞凋亡；(4)針對VEGF基因的有效RNA干擾可使VEGF基因mRNA水平下降，蛋白表達下調，但不抑制腫瘤細胞增殖，也不誘導腫瘤細胞凋亡；(5)利用pGenesil-

14、1Vector載體成功構建了針對hTERT基因和VEGF基因的質粒載體pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF和pGenesil-hTERT-VEGF，均能在細胞中長期表達siRNA，起到RNA干擾作用；(6)成功建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型；(7)pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF和pGenesil-hTERT-VEGF的裸鼠體內實驗表明這3種質粒載體均能有效地抑制鼻咽癌腫瘤的生長，促進腫瘤細胞的