siRNA抑制hTERT及VEGF表達(dá)治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)最為常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，我國(guó)是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，而國(guó)內(nèi)又以廣東、廣西、湖南、福建和江西南方 5 省發(fā)病率最高。鼻咽癌的原發(fā)部位深而隱蔽，不易觀察，與鼻腔、鼻竇及顱內(nèi)毗鄰，出現(xiàn)的早期癥狀各異，轉(zhuǎn)移率高，易早期轉(zhuǎn)移，常常容易誤診或漏診，延誤治療。鼻咽癌的發(fā)病人群以30～50歲的青壯年多見(jiàn)，一旦發(fā)病，可對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和家庭造成較大影響。因此，鼻咽癌早期診斷及治療的相關(guān)

2、研究一直是我國(guó)耳鼻咽喉科研工作的重點(diǎn)。 目前鼻咽癌的病因尚未完全明確，普遍認(rèn)為其發(fā)病與EB病毒的感染、環(huán)境及遺傳因素有關(guān)。鼻咽癌的治療主要是以放射治療為主，對(duì)中晚期鼻咽癌患者、鼻咽癌放療后復(fù)發(fā)患者以及放療效果欠佳的患者，可采取化學(xué)藥物治療，但僅屬輔助性治療或姑息性治療。因受鼻咽腔部位隱蔽、腔道狹小、四周結(jié)構(gòu)復(fù)雜、鼻咽癌低分化癌多見(jiàn)、易早期轉(zhuǎn)移、難以完整切除等特點(diǎn)的限制，鼻咽癌的手術(shù)治療僅僅在某些特殊情況下作為輔助方法采用。為了提

3、高鼻咽癌的治療效果，特別是為了解決對(duì)放療不敏感、放療后病灶殘留或放療后復(fù)發(fā)患者的治療難題，國(guó)內(nèi)外研究者近年來(lái)相繼開(kāi)展了各種生物治療研究，包括主動(dòng)及被動(dòng)免疫治療、基因治療、抗腫瘤血管生成治療、免疫調(diào)節(jié)劑和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑治療等，取得了一定的成果，但仍還不能達(dá)到臨床應(yīng)用的水平，我們?nèi)孕枰粩嗯Γ瑢ふ腋行У闹委熓侄?。目前，依?jù)腫瘤本身生物學(xué)特點(diǎn)及發(fā)生機(jī)制來(lái)制定基因治療方案已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，尤其是RNA干擾技術(shù)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用，為包括

4、鼻咽癌在內(nèi)的腫瘤的基因治療開(kāi)辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。 端粒的長(zhǎng)短與細(xì)胞壽命及增殖關(guān)系密切，端粒酶可以阻止端粒隨細(xì)胞分裂而逐漸縮短，從而穩(wěn)定染色體末端。端粒酶的激活可使細(xì)胞獲得永生，研究表明，端粒酶活性與惡性腫瘤關(guān)系密切。絕大部分惡性腫瘤細(xì)胞包括鼻咽癌細(xì)胞在內(nèi)均可檢測(cè)到端粒酶的活性表達(dá)，而在正常組織和良性腫瘤端粒酶活性絕大部分為陰性，hTERT是端粒酶的活性亞單位，因此，hTERT基因是一個(gè)很好的鼻咽癌基因治療的靶基因。 血管內(nèi)

5、皮因子VEGF是唯一能特異作用于內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，與鼻咽癌局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有密切的聯(lián)系。絕大多數(shù)惡性腫瘤中均呈現(xiàn)VEGF及其受體的高表達(dá)。研究表明，VEGF的高表達(dá)與腫瘤患者生存期及轉(zhuǎn)移有關(guān)，即VEGF高表達(dá)者易轉(zhuǎn)移，生存期短。鼻咽癌患者中VEGF陽(yáng)性高的病人，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)也高。目前利用VEGF基因開(kāi)展抗腫瘤血管新生治療越來(lái)越受到研究者的重視，惡性腫瘤中VEGF及其受體的協(xié)同表達(dá)，旁/自分泌作用機(jī)制的確立也為腫

6、瘤的基因治療提供了新的靶點(diǎn)。抑制VEGF及其受體，阻斷VEGF與其受體相互作用，可以達(dá)到阻止腫瘤血管新生，抑制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的目的，目前，鼻咽癌相關(guān)研究中VEGF與鼻咽癌的關(guān)系以及VEGF在鼻咽癌治療中的應(yīng)用日益受到關(guān)注。 RNA 干擾是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的新技術(shù)，它利用了由小干擾RNA引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對(duì)應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。它普遍存在于各

7、種生物，是一種集經(jīng)濟(jì)、快捷、高效、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)于一體的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，可廣泛用于基因功能測(cè)定及基因治療等方面。 本研究的目的是利用RNA干擾技術(shù)抑制hTERT基因和VEGF基因的表達(dá)，開(kāi)展對(duì)鼻咽癌的基因治療研究。整個(gè)研究?jī)?nèi)容分三部分進(jìn)行： 第一部分主要是siRNA的體外合成及鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)RNA干擾效應(yīng)的觀察 目的:確定針對(duì)hTERT基因和VEGF基因進(jìn)行RNA干擾的有效作用位點(diǎn)，觀察設(shè)計(jì)的sihTERT

8、和siVEGF在鼻咽癌中的RNA干擾效應(yīng)，為后續(xù)的質(zhì)粒構(gòu)建和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。通過(guò)利用在線網(wǎng)站的生物軟件設(shè)計(jì)多個(gè)針對(duì)hTERT基因和VEGF基因的RNA干擾片段，利用體外轉(zhuǎn)錄法快速合成相應(yīng)的siNRA，然后利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中，通過(guò)熒光顯微鏡觀察、半定量RT-PCR、Western Blot、流式細(xì)胞學(xué)檢查及TRAP-銀染法觀察NRA干擾效應(yīng)，確定RNA干擾最佳作用位點(diǎn)。 結(jié)果:確定了hTERT基因和VEG

9、F基因各2個(gè)有效作用位點(diǎn)，觀察到對(duì)hTERT基因和VEGF基因的有效RNA干擾可以將對(duì)應(yīng)基因的mRNA水平分別下調(diào)89％～92％、80％～95％，同時(shí)使其表達(dá)的蛋白水平下降。對(duì)hTERT基因的有效干擾還可以使腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，使其細(xì)胞周期受阻于G<,0>～G<,1>期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 第二部分主要是針對(duì)第一部分確定的hTERT基因和VEGF基因RNA干擾的有效作用位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的質(zhì)粒載體。

10、 方法:利用pGenesil-1 Vector載體，分別構(gòu)建針對(duì)hTER-T基因的RNA干擾質(zhì)粒pGenesil-hTERT、針對(duì)VEGF基因的pGenesil-VEGF質(zhì)粒、同時(shí)針對(duì)上述兩種基因的pGenesil-hTERT-VEGF質(zhì)粒，然后將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞，通過(guò)RF-PCR、Western Blot、MTT法來(lái)觀察RNA干擾效應(yīng)， 結(jié)果:成功構(gòu)建了pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF

11、及pGenesil-hTERT-VEGF質(zhì)粒，觀察到上述質(zhì)粒在CNE-2細(xì)胞可以表達(dá)siRNA，發(fā)揮RNA干擾效應(yīng)。 第三部分主要是進(jìn)行RNA干擾的裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，為今后的臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法:是將裸鼠接種CNE-2細(xì)胞建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，然后利用pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF及pGenesil-hTERT-VEGF質(zhì)粒分別進(jìn)行siRNA治療鼻咽癌的基因治療，通過(guò)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、測(cè)

12、量腫瘤大小繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線、TUNEL法計(jì)算腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)以及免疫組化等方法，觀察RNA干擾體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的效果， 結(jié)果:發(fā)現(xiàn)3種質(zhì)粒都能有效地抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而pGenesil-hTERT-VEGF質(zhì)粒的RNAi效應(yīng)要強(qiáng)于其他2個(gè)質(zhì)粒載體。 結(jié)論： (1)體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可在鼻咽癌中發(fā)揮特異性的RNA干擾效應(yīng)；(2)hTERT基因的位點(diǎn)的335～357、2324～2346，VEGF基因

13、的1130～1152、1504～1526為RNA干擾的有效作用位點(diǎn)；(3)針對(duì)hTERST基因的有效RNA干擾可導(dǎo)致鼻咽癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞增殖受抑，hTERT基因的mRNA水平下調(diào)，蛋白表達(dá)下降，端粒酶活性降低，細(xì)胞周期在G<,0>～G<,1>期受阻，并不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(4)針對(duì)VEGF基因的有效RNA干擾可使VEGF基因mRNA水平下降，蛋白表達(dá)下調(diào)，但不抑制腫瘤細(xì)胞增殖，也不誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；(5)利用pGenesil-

14、1Vector載體成功構(gòu)建了針對(duì)hTERT基因和VEGF基因的質(zhì)粒載體pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF和pGenesil-hTERT-VEGF，均能在細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)siRNA，起到RNA干擾作用；(6)成功建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型；(7)pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF和pGenesil-hTERT-VEGF的裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明這3種質(zhì)粒載體均能有效地抑制鼻咽癌腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的