靶向VEGF的siRNA聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的：探討慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及紫杉醇藥物敏感性的影響。 方法：設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF基因(NM003376)的siRNA寡核苷酸序列，與pGCL-GFP載體連接，構(gòu)建重組載體，經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后，將pGCL-GFP重組載體，pHelper1.0載體，pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生重組慢病毒顆粒VEGF-RNAi-LV并進(jìn)行滴度測(cè)定

2、。慢病毒VEGF-RNAi-LV轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞96h后，RT-PCR檢測(cè)SGC7901細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)，Westem Blot檢測(cè)細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清VEGF蛋白濃度，MTT法檢測(cè)RNAi及RNAi聯(lián)合紫杉醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，Hoechst33258染色及Annexin-V流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：重組慢病毒載體測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確，病毒包裝滴度為2х

3、109TU/ml。VEGF-RNAi-LV轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞96h后，其VEGF mRNA水平較空白對(duì)照組下降了78％; Western Blot未檢測(cè)到VEGF-RNAi-LV組細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，而對(duì)照組可檢測(cè)到蛋白的表達(dá)；細(xì)胞培養(yǎng)液上清VEGF蛋白濃度較空白對(duì)照組下降了93.9％; MTT結(jié)果顯示RNAi作用組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，VEGF-RNAi-LV轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性增加；流式細(xì)胞周期分析結(jié)果表明VEGF-RNAi

4、-LV轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞G0/G1期（細(xì)胞靜止期和DNA合成前期）比例升高，S期和G2/M期（DNA合成期和有絲分裂期）比例降低；Annexin-V結(jié)果顯示，VEGF-RNAi-LV組有11.67％的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而陰性對(duì)照組僅有4.23％的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；Hoechst33258染色結(jié)果證實(shí)VEGF-RNAi-LV組細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的RNAi可明顯抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901 VEGF基因和蛋白水平的