靶向VEGF的siRNA聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞增殖的研究.pdf

1、目的：探討慢病毒載體介導的RNAi對人胃癌細胞SGC7901血管內皮生長因子(VEGF)基因表達、細胞增殖、細胞凋亡及紫杉醇藥物敏感性的影響。 方法：設計針對VEGF基因(NM003376)的siRNA寡核苷酸序列，與pGCL-GFP載體連接，構建重組載體，經(jīng)DNA測序鑒定后，將pGCL-GFP重組載體，pHelper1.0載體，pHelper2.0共轉染293T細胞，包裝產(chǎn)生重組慢病毒顆粒VEGF-RNAi-LV并進行滴度測定

2、。慢病毒VEGF-RNAi-LV轉染SGC7901細胞96h后，RT-PCR檢測SGC7901細胞VEGF mRNA表達，Westem Blot檢測細胞VEGF蛋白表達，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液上清VEGF蛋白濃度，MTT法檢測RNAi及RNAi聯(lián)合紫杉醇對細胞增殖的影響，流式細胞術檢測細胞周期的變化，Hoechst33258染色及Annexin-V流式細胞術觀察細胞的凋亡。 結果：重組慢病毒載體測序結果準確，病毒包裝滴度為2х

3、109TU/ml。VEGF-RNAi-LV轉染SGC7901細胞96h后，其VEGF mRNA水平較空白對照組下降了78％; Western Blot未檢測到VEGF-RNAi-LV組細胞VEGF蛋白的表達，而對照組可檢測到蛋白的表達；細胞培養(yǎng)液上清VEGF蛋白濃度較空白對照組下降了93.9％; MTT結果顯示RNAi作用組細胞生長緩慢，VEGF-RNAi-LV轉染后的細胞對紫杉醇的敏感性增加；流式細胞周期分析結果表明VEGF-RNAi

4、-LV轉染后的細胞G0/G1期（細胞靜止期和DNA合成前期）比例升高，S期和G2/M期（DNA合成期和有絲分裂期）比例降低；Annexin-V結果顯示，VEGF-RNAi-LV組有11.67％的細胞出現(xiàn)凋亡，而陰性對照組僅有4.23％的細胞出現(xiàn)凋亡；Hoechst33258染色結果證實VEGF-RNAi-LV組細胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變。 結論：慢病毒介導的RNAi可明顯抑制人胃癌細胞SGC7901 VEGF基因和蛋白水平的