BMI-1在腫瘤發(fā)生中的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)BMI-1mRNA在白血病細(xì)胞中的表達(dá) 目的：建立SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)白血病細(xì)胞中BMI-1mRNA。方法：在TRIzol提取總RNA后，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)BMI-1mRNA在白血病細(xì)胞系，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過(guò)熔解曲線和凝膠電泳雙重確認(rèn)。結(jié)果：(1)BMI-1mRNA在白血病細(xì)胞系均存在表達(dá)，其中U937表達(dá)

2、最高，而HL-60表達(dá)最低。(2)與健康體檢者的外周血白細(xì)胞相比，BMI-1mRNA在白血病細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。結(jié)論：(1)SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)定量RT-PCR是一種快速有效、靈敏度高、特異性良好的定量檢測(cè)BMI-1mRNA的方法。(2)BMI-1參與白血病的發(fā)生，可能是一種新的腫瘤分子標(biāo)記物。 第二部分：BMI-1-pEGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在Hela細(xì)胞中的表達(dá) 目的：構(gòu)建并鑒定真核表達(dá)載

3、體BMI-1-pEGFP，觀察其在人類宮頸癌細(xì)胞系Hela中的過(guò)表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞周期和可能的下游基因表達(dá)的影響。方法：將BMI-1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)物克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-N1，經(jīng)酶切、PCR鑒定及測(cè)序分析，構(gòu)建BMI-1-pEGFP真核表達(dá)載體；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒BMI-1-pEGFPDNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察其表達(dá)。結(jié)果：(1)重組真核表達(dá)載體BMI-1-pEGFP已成功載入BMI-1的全

4、長(zhǎng)編碼基因(除終止密碼子外)，序列測(cè)定的結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致。(2)熒光顯微鏡下可見(jiàn)在轉(zhuǎn)染BMI-1-pEGFP融合基因的Hela細(xì)胞中存在熒光分布；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)BMI-1mRNA表達(dá)平均升高約1260倍，WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在外源性的融合蛋白BMI-1-EGFP的表達(dá)。(3)在Hela細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BMI-1顯著下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達(dá)，分別為對(duì)照組的9.2％、10.

5、9％和69.7％(P＜0.01)，而hTERT和HOXB4兩者mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化。(4)BMI-1-pEGFP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，G1期細(xì)胞由65.68％減少至50.53％，S期細(xì)胞由27.17％增加到29.59％，G2/M期細(xì)胞數(shù)目變化不明顯。結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒BMI-1-pEGFP。(2)BMI-1-pEGFP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后過(guò)表達(dá)BMI-1顯著下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表

6、達(dá)，而hTERT和HOXB4兩者mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著改變；同時(shí)G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加，這可能是BMI-1參與宮頸癌發(fā)生的機(jī)制之一。 第三部分：BMI-1shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其在Hela細(xì)胞中的表達(dá) 目的：針對(duì)BMI-1基因的不同部位構(gòu)建4種不同的BMI-1shRNA真核表達(dá)載體BMI-1shRNA1、2、3、4，轉(zhuǎn)染人類宮頸癌細(xì)胞系Hela篩選有效序列，并進(jìn)一步應(yīng)用G418抗性篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

7、方法：用DNA重組技術(shù)將針對(duì)人BMI-1基因的不同部位所設(shè)計(jì)的4對(duì)shRNA序列克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒psiRNA-hHlneo中。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Hela細(xì)胞中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9、HoxB4和HOXC13mRNA的表達(dá)變化，WesternBlot檢測(cè)BMI-1蛋白的表達(dá)變化，PI染色FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。結(jié)果：(1)4種shRNA表達(dá)載體BMI-1shRN

8、A1、2、3、4經(jīng)測(cè)序鑒定證明插入正確。(2)在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA1、2、3、4，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)BMI-1mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)只有BMI-1shRNA2和4能顯著下調(diào)BMI-1mRNA的表達(dá)，分別為對(duì)照組的40.1％、32.6％，抑制率分別為59.9％和67.4％，BMI-1蛋白的表達(dá)量明顯下降。(3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA2、4的Hela細(xì)胞中P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的

9、表達(dá)分別上調(diào)9-12倍、13-14倍、7-8倍，而hTERT和HOXB4兩者的mRNA表達(dá)量無(wú)變化變化。(4)BMI-1shRNA2和4轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少。結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體BMI-1shRNA1、2、3、4。(2)BMI-1shRNA2和4能有效地抑制BMI-1在Hela細(xì)胞中的表達(dá)；而在Hela細(xì)胞下調(diào)BMI-1能顯著上調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13的表達(dá)，同時(shí)導(dǎo)致G1期細(xì)

10、胞增加，S期細(xì)胞減少。 第四部分：過(guò)表達(dá)BMI-1對(duì)MDA-MB-231、MCF-7、K562、Jurkat的影響 目的：將第二部分構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體BMI-1-pEGFP分別轉(zhuǎn)染人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7、人類白血病細(xì)胞系K562和Jurkat，分別觀察BMI-1的過(guò)表達(dá)以及對(duì)可能的下游基因表達(dá)的影響。方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒BMI-1-pEGFPDNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-

11、7、K562和Jurkat細(xì)胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，WesternBlot檢測(cè)BMI-1蛋白的表達(dá)變化，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)其中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9和HOXC13mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：(1)熒光顯微鏡下可見(jiàn)在轉(zhuǎn)染BMI-1-EGFP融合基因的MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞中存在熒光分布，BMI-1mRNA的表達(dá)水平分別平均升高78.63、65.72、43.25和3

12、6.78倍。(2)在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BMI-1分別平均上調(diào)hTERTmRNA的表達(dá)36.53倍和27.33倍，分別下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達(dá)為各自對(duì)照組的62.8％和57.4％、65.7％和63.5％、73.5％和69.3％，而MCF-7細(xì)胞中不表達(dá)HOXB4mRNA。(3)在K562和Jurkat細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BMI-1能顯著下調(diào)HOXC13mRNA的表達(dá)，分別為各自對(duì)照

13、組的64.8％和67.2％，而HOXB4mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化。結(jié)論：(1)真核表達(dá)質(zhì)粒BMI-1-pEGFP轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞能表達(dá)融合蛋白BMI-1-EGFP。(2)在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BMI-1顯著上調(diào)hTERTmRNA的表達(dá)，下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達(dá)。(3)在K562和Jurkat細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BMI-1顯著下調(diào)HO

14、XC13mRNA的表達(dá)，HOXB4mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著改變。 第五部分：BMI-1沉默對(duì)MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞的抑制作用 目的：將第三部分構(gòu)建成功并鑒定的真核表達(dá)載體BMI-1shRNA2、4分別轉(zhuǎn)染人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7、人類白血病細(xì)胞系K562和Jurkat，分別觀察BMI-1在MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞中的下調(diào)以及對(duì)

15、可能的下游基因表達(dá)的影響。方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒BMI-1shRNA2、4DNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，WesternBlot檢測(cè)BMI-1蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)表達(dá)變化。結(jié)果：(1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA2、4的MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞中BMI-1mRNA的表達(dá)水平分別降低為各自對(duì)照組的34.2％和28.6

16、％、36.5％和32.1％、42.5％和35.4％、40.8％和34.6％，BMI-1蛋白表達(dá)分別降低為各自對(duì)照組的40.9％和35.6％、42.7％和38.5％、45.6％和37.6％、43.4％和36.8％。(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA2、4的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中hTERTmRNA的表達(dá)分別降低為各自對(duì)照組的65.2％和59.6％、62.7％和58.4％；P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA

17、的表達(dá)水平分別升高7-9倍、10-12倍、6-8倍，而MCF-7細(xì)胞中不表達(dá)HOXB4mRNA，后者在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)量無(wú)明顯變化。(3)K562和Jurkat細(xì)胞不表達(dá)P16INK4a和HOXA9mRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA2、4的K562和Jurkat細(xì)胞中HOXC13mRNA的表達(dá)水平分別升高8-10倍、9-11倍，而HOXB4mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯改變。結(jié)論：(1)真核表達(dá)質(zhì)粒BMI-1shRNA2、4

18、轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細(xì)胞能顯著下調(diào)BMI-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA2、4的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中hTERTmRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，而P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達(dá)則顯著上調(diào)。(3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1shRNA2、4的K562和Jurkat細(xì)胞中HOXC13mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而HOXB4mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著改變