HDAC4磷酸化水平對腦缺血后血管新生的影響及其機制探討.pdf

1、研究背景與目的:
　　腦血管疾病、心臟疾病和惡性腫瘤是人類死亡的三大主要疾病。腦卒中發(fā)生后,常導致患者死亡或遺留嚴重的神經功能障礙,給家庭和社會帶來沉重負擔,危害甚大。流行病學資料數據顯示,在全部腦血管疾病中,缺血性腦卒中約占到80％。針對缺血性腦卒中目前仍沒有很好的治療手段,且效果有限。有學者提出如能盡早促進缺血區(qū)新生血管形成恢復局部血流,不僅有利挽救半影區(qū)的神經元,而且為其后功能修復中的神經干細胞存活、增殖和功能重塑等提供良好

2、的微環(huán)境,最大限度改善預后。因此如何盡早恢復血流促進新生血管形成對于缺血性卒中的治療具有重大意義。
　　血管新生(angiogenesis)是指在原有血管基礎上芽生出新的血管、廣泛重建后形成穩(wěn)定血管網絡的復雜過程。血管新生受到多種生長因子共同調控,是多種相關基因多步驟協同作用的共同結果。缺氧誘導因子-l(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial

3、 growth factor, VEGF)是研究較早的廣泛應用于缺血性疾病研究的調控因子。HIF-VEGF信號通路是缺血缺氧后調節(jié)血管新生的重要機制之一,但其調控血管新生的關鍵環(huán)節(jié)還有待進一步闡明。
　　表觀遺傳學(epigenetics)修飾在血管新生調控過程中也扮演了非常重要的角色。組蛋白修飾是表觀遺傳修飾中的一種重要的調節(jié)方式,其中組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙

4、酰化酶(histone deacetylases, HDACs)在組蛋白修飾過程中不可或缺。在組織發(fā)育和腫瘤血管生成研究中發(fā)現,活化的關鍵 HDACs對于血管新生的發(fā)生和完善起到了關鍵性調節(jié)作用。HDAC4(histone deacetylase4)是HDACs家族成員之一,存在多個磷酸化位點。研究發(fā)現HDAC4蛋白磷酸化后能夠從細胞核轉移至細胞質,從而激活下游與血管相關基因的表達。然而在發(fā)生缺血性腦卒中時磷酸化HDAC4是否也參與調控

5、血管的新生其調控機制如何,其與已知的 HIF-VEGF信號通路的又是如何相互影響目前尚不得知。
　　據此,本研究通過觀察體內外缺血缺氧時信號通路分子 HIF-1α、VEGFa、HDAC4及 P-HDAC4632蛋白等變化規(guī)律,初步探討 HDAC4磷酸化水平對腦缺血后血管新生過程的可能影響及其機制,以期深入理解腦卒中后血管新生的分子調控機制,并為腦卒中等缺血性疾病的修復治療提供新的科學依據。
　　研究內容和方法:
　　1

6、.體內實驗
　　1.1、根據缺血再灌注不同時間點分為24h和48h組。制作大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型(參考Longa法),分別于缺血再灌注后24h、48h分批處死各組大鼠,取腦組織標本待檢。
　　1.2、腦組織標本冰凍切片行免疫組織化學熒光染色分別檢測24h和48h缺血再灌注后CD31表達,比較不同時間點缺血側及健側皮質微血管密度,以了解缺血區(qū)血管新生情況

7、。
　　1.3、采用Western blot法分別檢測24h和48h缺血再灌注后大腦缺血皮質和健側皮質中HIF-1α、VEGFa、HDAC4和P-HDAC4632蛋白表達水平。
　　2.體外實驗
　　2.1、構建HMEC-1細胞缺氧和藥物干預模型,隨機分為常氧組(N)、缺氧組(H)、磷酸化酶抑制劑干預組(H+G)。
　　2.2、采用Western blot法分別檢測不同組別細胞內HIF-1α、VEGFa、HDAC

8、4和P-HDAC4632蛋白表達水平。
　　2.3、采用實時熒光定量PCR檢測不同組別細胞內VEGF下游成血管相關基因RCAN2表達變化。
　　2.4、觀察不同組別HMEC-1細胞成管能力變化情況。
　　結果:
　　1.體內實驗
　　1.1、大鼠腦中動脈腦經梗塞后均出現程度不等的神經功能缺失表現,包括對側肢體偏癱、眼瞼下垂、行走時原地轉圈和向對側傾斜、提尾向對側側身等一系列異常反應;TTC染色見右側大腦中動

9、脈供血區(qū)域呈蒼白色,而周圍正常腦組織呈紅色;上述表現均提示腦缺血模型制作成功。
　　1.2、免疫組織化學熒光染色分別檢測24h和48h缺血再灌注后CD31表達,結果顯示缺血側皮質微血管密度明顯多于健側皮質,且缺血再灌注48h后缺血側半暗區(qū)新生微血管密度顯著高于再灌注24h后。
　　1.3、Western blot檢測結果表明缺血再灌注24h后,缺血側半暗區(qū)皮質HIF-1α和VEGFa蛋白表達明顯要高于健側皮質;但是隨著灌注的

10、時間的延長至48h后,缺血側半暗區(qū)皮質P-HDAC4632蛋白也明顯高于健側皮質;其中各組別總HDAC4蛋白表達水平無明顯差異性。
　　2.體外實驗
　　2.1、在體外使用缺氧條件(1% O2濃度、5%CO2濃度)培養(yǎng)HMEC-1(人類微血管內皮細胞),其中一組為單純缺氧組(H組),另一組使用藥物G6976預處理細胞30min后再缺氧培養(yǎng)(H+G組),均以常氧組(21% O2濃度、5%CO2濃度)為對照組。
　　2.2

11、、缺氧或藥物刺激12h后,各組細胞在缺氧條件下無論是否添加磷酸化酶抑制劑G6976干預,Western blot檢測結果表明HIF-1α和VEGFa蛋白均高表達。在各組當中HDAC4總蛋白表達水平無明顯差異性,但P-HDAC4632蛋白與HIF-1α和VEGFa蛋白表達情況并不一致,H組P-HDAC4632明顯高表達于常氧組,而H+G組P-HDAC4632蛋白表達減少。
　　2.3、實時熒光定量 PCR檢測結果表明,相比常氧對照組

12、,單純缺氧組RCAN2基因明顯高表達;然而使用磷酸化酶抑制劑G6976預處理之后,RCAN2基因表達水平明顯減少。
　　2.4相比較于常氧組,H組HMEC-1細胞成管能力明顯增強;而H+G組細胞成管受到限制。
　　結論:
　　本研究的體內腦缺血動物模型實驗結果顯示,腦缺血后缺血皮質區(qū)微血管密度增多,缺血皮質區(qū)HIF-1α和VEGFa表達明顯上調,同時伴隨HDAC4蛋白磷酸化水平的明顯變化;進一步通過體外血管內皮細胞缺氧