Toll樣受體4激活對異常磷酸化Tau蛋白的調(diào)節(jié)及其機制研究.pdf

1、第一部分神經(jīng)炎癥對小鼠腦內(nèi)自噬水平的調(diào)控及作用機制
　　目的：本部分實驗分別從生理及病理情況下誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，通過自噬相關(guān)標(biāo)記物的測定研究神經(jīng)炎癥對小鼠腦內(nèi)自噬水平的調(diào)控及作用機制。
　　方法：在體實驗分別構(gòu)建了在腦內(nèi)骨髓系細胞中特異性敲除 ikbkb基因的老年小鼠（18月齡）；以及在腦內(nèi)髓細胞系中特異性敲除ikbkb，mapk14和myd88基因的年輕小鼠（3月齡），取同窩生的野生型小鼠作為對照。以細菌脂多糖（lipopol

2、ysaccharide，LPS）作為誘導(dǎo)病理情況下神經(jīng)炎癥的工具藥。分別給予3月齡及18月齡C57BL6J野生型小鼠每隔兩天一次的LPS（1mg/kg）腹腔注射，并持續(xù)注射1周，總共4次，并取同窩生的野生型小鼠注射PBS作為對照；用同樣的方法處理腦內(nèi)髓細胞系中特異性敲除ikbkb，mapk14和myd88基因的小鼠。熒光定量PCR檢測小鼠腦內(nèi)炎癥因子tnf-?、l-1?及mcp-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；Western blotting方法

3、在蛋白水平檢測腦內(nèi)自噬相關(guān)蛋白 LC3B，Beclin1和 p62的表達量；分別使用Western blotting方法和組織免疫熒光標(biāo)記的方法檢測腦內(nèi)海馬區(qū)的Iba1蛋白的表達量及 Iba1陽性細胞數(shù)。離體實驗構(gòu)建了骨髓源性巨噬細胞與轉(zhuǎn)染了自噬重組質(zhì)粒的SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)的觀測體系，激光共聚焦觀察經(jīng)不同濃度、時間點處理后神經(jīng)細胞內(nèi)mRFP-GFP-LC3點狀聚集情況。
　　結(jié)果：
　　1.衰老誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥對小鼠腦內(nèi)

4、自噬水平的影響：在腦內(nèi)骨髓系細胞中特異性敲除IKK?蛋白的老年小鼠的神經(jīng)炎癥水平下調(diào)，自噬相關(guān)蛋白的表達同時出現(xiàn)下降。
　　2.小膠質(zhì)細胞 Toll樣受體4激活對小鼠腦內(nèi)自噬水平的影響：1）與接受 PBS注射的對照組相比，接受LPS注射的小鼠（3月齡及18月齡）腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞炎性激活，腦內(nèi)炎癥因子tnf-?和 il-1?的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，同時自噬相關(guān)蛋白LC3B，Beclin1表達水平升高，在老年小鼠中，LPS誘導(dǎo)LC3

5、B-II增加的比率較年輕小鼠更多。2）與髓細胞內(nèi)表達IKK?,p38?-MAPK和MyD88蛋白正常的小鼠相比，相應(yīng)基因敲除的小鼠在接受 LPS注射后神經(jīng)炎癥水平有顯著變化，而該變化與腦內(nèi)自噬水平的變化一致。3）激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染了mRFP-GFP-LC3的SH-SY5Y細胞內(nèi)GFP、RFP點狀聚集在接受了巨噬細胞共培養(yǎng)條件下的LPS刺激后顯著增加，該效果呈劑量依賴性地增強。
　　結(jié)論：（1）衰老誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與小鼠腦內(nèi)自噬水平增

6、加相關(guān)（2）LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與不同年齡小鼠腦內(nèi)自噬水平增加相關(guān)。（3）接受 LPS處理后，不同炎癥相關(guān)基因敲除小鼠的神經(jīng)炎癥變化水平與腦內(nèi)自噬變化水平相關(guān)。（4）LPS誘導(dǎo)的髓細胞性炎癥引起SH-SY5Y報告細胞自噬上調(diào)。本實驗為探討生理及病理不同情況下的神經(jīng)炎癥對神經(jīng)自噬的影響提供了實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分長期低水平誘導(dǎo)的Toll樣受體4激活通過自噬溶酶體途徑降解異常磷酸化Tau蛋白
　　目的：本部分實驗觀察低水平長期

7、 TLR4激活誘導(dǎo)下的神經(jīng)炎癥對神經(jīng)元自噬水平的影響，以及該處理對Tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)異常磷酸化Tau蛋白的調(diào)控及其相關(guān)機制。
　　方法：在體實驗構(gòu)建了過表達人源性P301S變異型微管相關(guān)Tau蛋白的轉(zhuǎn)基因AD小鼠，以細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的工具藥。分別給予6月齡上述轉(zhuǎn)基因小鼠每周一次LPS（0.15mg/kg）腹腔注射，持續(xù)注射12周，并取同窩生的轉(zhuǎn)基因小鼠注射PBS作為對照。

8、熒光定量PCR檢測小鼠腦內(nèi)炎癥因子tnf-?、l-1?的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；組織免疫熒光標(biāo)記的方法檢測小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞蛋白標(biāo)記Iba1和S100陽性的細胞數(shù)；Western blotting方法檢測p65，ERK42/44，p38?-MAPK三種蛋白的磷酸化水平來評估該處理下的神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)情況。使用Western blotting方法在蛋白水平檢測腦內(nèi)自噬相關(guān)蛋白 LC3B，Beclin1和p62的表達量；組織免疫熒光標(biāo)

9、記的方法檢測小鼠大腦皮層內(nèi)LC3A/B陽性細胞數(shù)。使用梯度萃取的方法檢測不同組分中磷酸化Tau蛋白的含量，并使用Western blotting方法半定量分析；組織免疫熒光標(biāo)記的方法檢測小鼠大腦內(nèi) AT8免疫信號陽性的神經(jīng)元數(shù)量。使用Western blotting方法在蛋白水平檢測腦內(nèi)激酶GSK3α/β和p38-MAPK的磷酸化水平；腦組織溶酶體成分純化萃取法提取純化溶酶體，并使用Western blotting方法檢測溶酶體蛋白LA

10、MP-1、磷酸化Tau及非溶酶體成分的calnexin和?-actin的蛋白表達量；激光共聚焦觀察自噬囊泡標(biāo)記物 p62及磷酸化 Tau共定位情況。使用Morris水迷宮實驗測試Tau轉(zhuǎn)基因小鼠接受不同處理后的行為學(xué)指標(biāo)；組織免疫熒光標(biāo)記的方法檢測小鼠大腦突觸蛋白標(biāo)記物synaptophysin表達量；Western blotting方法檢測突觸結(jié)構(gòu)蛋白PSD95和Munc18-1含量。離體實驗構(gòu)建了人源性ATG5顯性失活突變及野生型質(zhì)

11、粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細胞，Western blotting方法檢測在骨髓源性巨噬細胞共培養(yǎng)體系中，接受LPS刺激后磷酸化Tau蛋白的含量。
　　結(jié)果：
　　1.長期低水平的 TLR4激活對小鼠腦內(nèi)自噬水平的影響：長期低水平的 TLR4激活增強Tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)自噬水平。
　　2.長期低水平的TLR4激活對Tau轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)炎癥的影響：1）與接受PBS注射的對照組相比，接受LPS注射的小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞蛋白標(biāo)記物I

12、ba1表達增高，但通過Iba-1免疫熒光染色陽性的細胞數(shù)并未顯著增加；星形膠質(zhì)細胞數(shù)量通過計數(shù)S100陽性細胞也未發(fā)現(xiàn)有顯著增加。2）接受LPS注射后小鼠腦內(nèi)炎癥因子tnf-?和il-1?的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平也沒有出現(xiàn)變化。3）炎癥相關(guān)激酶 p65，ERK42/44，p38?-MAPK三者磷酸化水平在接受LPS注射后也均未有顯著變化。4）接受LPS注射后小鼠體重?zé)o明顯下降，也并未出現(xiàn)免疫耐受。上述結(jié)果充分表明，長期低水平的TLR4激活不

13、會引起嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。
　　3.長期低水平的TLR4激活對腦內(nèi)異常磷酸化Tau蛋白的影響：與接受PBS注射的對照組相比，接受LPS注射的小鼠腦內(nèi)異常磷酸化Tau蛋白含量在RIPA和甲酸組分中顯著下降；AT8免疫信號陽性的神經(jīng)元數(shù)量也明顯少于PBS處理組。
　　4.長期低水平的TLR4激活對腦內(nèi)異常磷酸化Tau蛋白調(diào)控機制：1）長期低水平的TLR4激活并不影響激酶GSK3α/β和p38-MAPK的磷酸化水平，提示其并不影響

14、磷酸化Tau蛋白的生成。2）長期低水平的TLR4激活促進腦內(nèi)溶酶體形成，并促進異常磷酸化Tau蛋白進入溶酶體。3）自噬囊泡標(biāo)記物p62及磷酸化Tau共定位提示異常磷酸化 Tau蛋白的確可以通過自噬溶酶體途徑進行降解。4）ATG5顯性失活突變SH-SY5Y細胞磷酸化Tau蛋白量在與巨噬細胞共培養(yǎng)體系中接受LPS刺激后無明顯變化，而ATG5野生型含量下降提示炎癥的確能通過自噬溶酶體途徑降解異常磷酸化Tau蛋白。
　　5.長期低水平的T

15、LR4激活對Tau轉(zhuǎn)基因小鼠AD相關(guān)癥狀的影響及機制：1）長期低水平的TLR4激活能改善Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。2）長期低水平的TLR4激活能減少小鼠神經(jīng)元突觸的損傷。
　　結(jié)論：（1）長期低水平的TLR4激活增強小鼠腦內(nèi)自噬。（2）長期低水平的TLR4激活不引起嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。（3）長期低水平的TLR4激活促進異常磷酸化Tau蛋白的降解。（4）自噬溶酶體介導(dǎo)了TLR4激活誘導(dǎo)的異常磷酸化Tau蛋白的降解。（5）長