青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp蛋白互作分析.pdf

1、細(xì)菌通過設(shè)計(jì)精巧的蛋白傳輸系統(tǒng)，泌出毒性因子和效應(yīng)子，與寄主進(jìn)行分子交流。其中，Ⅱ型分泌系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中。Ⅱ型分泌系統(tǒng)主要以分泌途徑轉(zhuǎn)膜蛋白(GSP)基因簇為中心。植物細(xì)菌性青枯病是我國(guó)和世界范圍內(nèi)廣泛分布和發(fā)生的一種重要細(xì)菌病害，青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)與致病蛋白的分泌密切相關(guān)。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，對(duì)青枯菌GMI1000菌株Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp蛋白之間的互作關(guān)系進(jìn)行了分析研究。 根據(jù)青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)中12個(gè)gsp

2、基因的上下游序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出12對(duì)最佳gsp基因擴(kuò)增引物?？朔薵sp基因GC％含量偏高(67.1-74.4％)、難以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的困難，通過PCR體系條件優(yōu)化，成功地完成了青枯菌GMI1000菌株Ⅱ型分泌系統(tǒng)12個(gè)gsp基因的克隆。 分別將12個(gè)gsp基因連接到酵母雙雜交研究體系的誘餌載體pGBKT7及捕獲載體pGADT7上，成功地構(gòu)建了gsp基因誘餌庫(kù)和捕獲庫(kù)。經(jīng)過序列測(cè)定，證明12個(gè)gsp基因讀框正確，保障了

3、gsp基因在酵母體系中正確的表達(dá)。 成功地將誘餌庫(kù)和捕獲庫(kù)共轉(zhuǎn)化到AH109酵母菌株中，發(fā)現(xiàn)在酵母雙雜交體系中，GspL和GspE；GspL和GspM；GspG和GspE；GspC和GspL及GspⅠ和GspJ蛋白之間可能存在相互作用。經(jīng)載體互換后，證實(shí)了GspL和GspE；GspL和GspM；GspG和GspE蛋白之間互作的真實(shí)性。 本研究首次將酵母雙雜交技術(shù)引入到青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp蛋白的互作研究中，實(shí)驗(yàn)得到了三