壬基酚的熒光定量PCR檢測(cè)新方法研究.pdf

1、壬基酚(nonylphenol，NP)是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)中具有代表性的物質(zhì)，且化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，易富集于沉積物中，不易降解，暴露到環(huán)境中可導(dǎo)致生物與人體的性激素分泌量及活性下降，精子數(shù)量減少，生殖器官異常，癌癥等疾病的發(fā)病率增加，并使生殖能力降低，后代的健康與成活率下降，同時(shí)還可能影響到各種生物的免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，也可能導(dǎo)致生物基因突變等。目前壬基酚的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用和高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法，

2、后來(lái)又發(fā)展成固相萃取、吹掃捕集與氣相色譜法聯(lián)用，免疫分析方法和化學(xué)發(fā)光法偶有報(bào)道。用色譜法不僅昂貴費(fèi)時(shí)，而且分析過(guò)程繁瑣冗長(zhǎng)。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了許多壬基酚的生物檢測(cè)方法。生物檢測(cè)中，PCR檢測(cè)技術(shù)由于其靈敏度高，檢測(cè)限更低，受到了廣泛關(guān)注。SYBR Green I熒光定量PCR是近年來(lái)出現(xiàn)的具有高靈敏度的定量PCR方法。目前，在壬基酚檢測(cè)領(lǐng)域，PCR技術(shù)主要應(yīng)用檢測(cè)壬基酚的雌激素效應(yīng)，直接用于檢測(cè)環(huán)境樣本中壬基酚的含量的研

3、究報(bào)導(dǎo)較少。本文采用體外DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)合外切酶消解與熒光定量PCR技術(shù)，建立一種壬基酚的熒光定量PCR檢測(cè)新方法。
　　 壬基酚可以活化雌激素受體，使之與包含特定序列的雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合的DNA因受到蛋白質(zhì)的保護(hù)可抵抗核酸外切酶ExonucleaseⅢ的消解而被保留下來(lái)，痕量的保留DNA可通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)。根據(jù)此原理，本研究首先從魚(yú)肝臟中提取含雌激素受體的細(xì)胞溶質(zhì)，與不同濃度的壬基酚結(jié)合使雌激素受體活化，形成受體-配體復(fù)

4、合物。再設(shè)計(jì)合成特異性引物序列，采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增制備雙鏈結(jié)合DNA；使雙鏈結(jié)合DNA與受體-配體復(fù)合物反應(yīng)結(jié)合后，用核酸外切酶和S1酶消解，去除未受到蛋白質(zhì)保護(hù)的結(jié)合DNA。將消解后產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而建立Ct值與壬基酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)探索最優(yōu)反應(yīng)條件，并確定熒光定量PCR的最低檢測(cè)限及其結(jié)果的重復(fù)性。將該方法用于檢測(cè)實(shí)際環(huán)境樣品中壬基酚的含量，并將檢測(cè)結(jié)果同高效液相色譜法進(jìn)行比較，比較兩種檢測(cè)方法的

5、不同。
　　 本課題主要試驗(yàn)結(jié)果表明：
　　 (1)壬基酚暴露條件下，魚(yú)體內(nèi)可產(chǎn)生較多的雌激素受體；實(shí)驗(yàn)中采用羥基磷灰石微量法，將配體受體復(fù)合物純化，效果顯著，可減少PCR實(shí)驗(yàn)中的非特異性擴(kuò)增。采用SPR定性鑒定受體-配體復(fù)合效果，在加入壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10-8-10-2g/L范圍內(nèi)，壬基酚配體濃度與受體-配體復(fù)合物的SPR響應(yīng)強(qiáng)度之間呈線性關(guān)系。
　　 (2)以已知拷貝數(shù)的DNA做定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

6、曲線，及不同濃度壬基酚對(duì)應(yīng)的模板拷貝數(shù)，得到壬基酚濃度與Ct的關(guān)系曲線，為：Ct=-1.828×log(壬基酚濃度)+11.447。分析可知，壬基酚濃度為10-8-10-2mol/L時(shí)，線性關(guān)系顯著(R2=0.99523)。確定本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR法對(duì)壬基酚的最低檢測(cè)限為10-8mol/L。
　　 (3)高效液相色譜法檢測(cè)壬基酚及與PCR方法的比較：論文建立了高效液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)直線，考察了方法的檢測(cè)限并應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境樣品