骨壞死修復(fù)機(jī)制及局部應(yīng)用唑來膦酸調(diào)節(jié)成骨-破骨活動的研究.pdf

1、第一部分:局部冷熱交替和注射無水乙醇致骨壞死修復(fù)機(jī)制的研究
　　目的:
　　探索局部冷熱交替和注射無水乙醇致大鼠股骨髁發(fā)生骨壞死的可能,比較不同損傷方式致骨壞死后骨修復(fù)的差異,分析成骨/破骨活動在骨壞死修復(fù)過程中的作用。
　　方法:
　　30只成年SD大鼠隨機(jī)分成兩組:一組通過采用液氮-恒溫水交替方式在大鼠右側(cè)股骨髁進(jìn)行冷熱損傷造模,另一組在右側(cè)股骨髁采用局部注射無水乙醇的方式造模,左側(cè)股骨髁設(shè)為正常對照組。術(shù)后

2、8周處死實(shí)驗(yàn)動物獲取股骨髁標(biāo)本后,采用顯微CT進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析,納米壓痕技術(shù)測定骨小梁微觀力學(xué)特性,病理學(xué)觀察并測定骨形成速率,ALP染色和TRAP染色鑒定成骨/破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)比較。
　　結(jié)果:
　　1.顯微CT結(jié)果顯示,與正常對照組相比,冷熱損傷組骨礦密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BVF)、骨小梁數(shù)量(Tb.N.)顯著降低;無水乙醇組骨礦密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BVF)、骨小梁厚度(Tb.Th.)顯著增高。
　

3、　2.病理學(xué)結(jié)果顯示,在兩種損傷組中均可見大量死骨形成,空骨陷窩明顯,冷熱損傷組骨小梁結(jié)構(gòu)斷裂紊亂,無水乙醇組壞死骨小梁結(jié)構(gòu)完整并且周圍可見大量新生骨。
　　3.四環(huán)素-鈣黃綠素標(biāo)記結(jié)果顯示,與正常對照組相比,無水乙醇組骨形成率顯著增高;而冷熱損傷組無顯著差異。
　　4.納米壓痕測定結(jié)果顯示,與正常對照組相比,無水乙醇組骨小梁微觀彈性模量和硬度無顯著差異;而冷熱損傷組顯著降低。
　　5.成骨/破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與正

4、常對照組相比,無水乙醇組破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少,而成骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加;冷熱損傷組破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加,成骨細(xì)胞數(shù)量無顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.局部冷熱交替損傷和注射無水乙醇均可以導(dǎo)致骨壞死發(fā)生。
　　2.局部冷熱交替損傷致骨壞死修復(fù)時,破骨活動增強(qiáng),骨小梁微觀力學(xué)性能降低,呈破壞性修復(fù)。
　　3.局部注射無水乙醇致骨壞死修復(fù)時,成骨活動增強(qiáng),破骨活動減弱,骨小梁微觀力學(xué)性能升高,呈重建性修復(fù)。
　　第

5、二部分:PLGA局部緩釋唑來膦酸促進(jìn)骨形成的研究
　　目的:
　　觀察PLGA局部緩釋唑來膦酸對骨組織代謝的影響,探討雙膦酸鹽局部緩釋調(diào)節(jié)成骨/破骨活性的機(jī)制。
　　方法:
　　40只成年SD大鼠隨機(jī)分成四組:右側(cè)股骨髁分別植入不同含量唑來膦酸的PLGA藥棒:1.空白對照組(0μg);2.低劑量組(唑來膦酸3μg);3.中劑量組(唑來膦酸30μg);4.高劑量組(唑來膦酸300μg)。術(shù)后6周處死實(shí)驗(yàn)動物獲取股骨

6、髁標(biāo)本后,采用顯微CT進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析,病理學(xué)染色觀察骨形成情況,ALP染色和 TRAP染色鑒定成骨/破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)比較,免疫組織化學(xué)染色分析骨形成相關(guān)因子表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.顯微CT結(jié)果顯示,在中劑量組和高劑量組中,股骨髁骨骺近端可見大量礦化組織形成。三種劑量唑來膦酸緩釋組中的平均骨礦密度(BMD)和骨體積分?jǐn)?shù)(BVF)都顯著高于空白對照組。中劑量組和高劑量組中骨小梁平均厚度(Tb.Th.)顯著高于低劑量組和空

7、白對照組。
　　2.病理學(xué)結(jié)果顯示,在中劑量組和高劑量組中,大量新生骨組織形成,但是骨小梁板層結(jié)構(gòu)不明顯,排列結(jié)構(gòu)紊亂,呈不成熟新生網(wǎng)織骨表現(xiàn)。
　　3.成骨/破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,中劑量組和高劑量組中破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少,成骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加。
　　4.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,中劑量組和高劑量組中骨形成相關(guān)因子:骨形態(tài)蛋白2(BMP2),骨鈣蛋白(OCN),骨形態(tài)蛋白7(BMP7),

8、Ⅰ型膠原(ColⅠ)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)的表達(dá)均顯著增高。
　　結(jié)論:
　　1.PLGA緩釋唑來膦酸能夠促進(jìn)局部骨組織形成,但是新生骨組織病理學(xué)表現(xiàn)為不成熟的網(wǎng)織骨。
　　2.PLAG緩釋不同濃度的唑來膦酸能夠抑制局部破骨細(xì)胞介導(dǎo)的破骨活動,促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的成骨活動。
　　3.PLAG緩釋不同濃度的唑來膦酸能夠促進(jìn)局部骨形成相關(guān)因子的表達(dá)。
　　第三部分:復(fù)合唑來膦酸脫細(xì)胞骨基質(zhì)的制備及

9、對體外培養(yǎng)成骨/破骨細(xì)胞的影響
　　目的:
　　利用唑來膦酸對骨組織的高親和性,將不同濃度唑來膦酸與脫細(xì)胞骨基質(zhì)復(fù)合,觀察其對體外成骨/破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系的影響。
　　方法:
　　采用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)去污劑方法制備豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨骨基質(zhì),將脫細(xì)胞骨基質(zhì)浸潤于不同濃度的唑來膦酸溶液(空白對照組、10-5M組、10-6

10、M組和10-7M組)24小時,使唑來膦酸與脫細(xì)胞骨基質(zhì)進(jìn)行復(fù)合。采用核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator for nuclear factor-κ B ligand,RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)體外建立大鼠成骨/破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,與復(fù)合唑來膦酸的脫細(xì)胞骨基質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)7天后,ALP染色和TRAP染色鑒定成骨/破骨細(xì)胞

11、并計(jì)數(shù)比較,實(shí)時定量qRT-PCR和蛋白印跡法Western blot分析成骨/破骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.TRAP染色破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,復(fù)合不同濃度的脫細(xì)胞骨基質(zhì)均能顯著抑制破骨細(xì)胞的形成。
　　2.ALP染色成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,復(fù)合不同濃度的脫細(xì)胞骨基質(zhì)均能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成。
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白對照組相比,高濃度和中濃度組

12、中RANK基因表達(dá)顯著降低,低濃度組中RANKL基因表達(dá)顯著降低,三組實(shí)驗(yàn)組中OPG基因表達(dá)均顯著增高。
　　4.Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組相比,高濃度和中濃度組中RANK因子表達(dá)顯著降低,中濃度組中RANKL因子表達(dá)增高,低濃度組中RANKL因子表達(dá)顯著降低,三組實(shí)驗(yàn)組中OPG因子表達(dá)均顯著增高。
　　結(jié)論:
　　1.復(fù)合唑來膦酸脫細(xì)胞骨基質(zhì)可以有效在體外抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化。
　　2.

13、復(fù)合唑來膦酸脫細(xì)胞骨基質(zhì)可以有效在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。
　　3.復(fù)合唑來膦酸脫細(xì)胞骨基質(zhì)可以升高成骨-破骨共培養(yǎng)體系中OPG/RANKL比率。
　　第四部分:復(fù)合唑來膦酸脫細(xì)胞骨基質(zhì)促進(jìn)局部骨形成的研究
　　目的:
　　觀察復(fù)合唑來膦酸脫細(xì)胞骨基質(zhì)對體內(nèi)骨組織代謝的影響,探索通過復(fù)合雙膦酸鹽調(diào)節(jié)成骨/破骨活性防止移植骨吸收,促進(jìn)宿主骨形成的可能方法。
　　方法:
　　40只成年SD大鼠隨機(jī)分成四組

14、,將復(fù)合不同濃度唑來膦酸豬脫細(xì)胞骨基質(zhì)(空白對照組、10-5M組、10-6M組和10-7M組)植入大鼠脛骨近端預(yù)制骨隧道,術(shù)后8周處死實(shí)驗(yàn)動物獲取脛骨近端標(biāo)本后,采用顯微CT分別對移植骨和宿主骨進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析,納米壓痕技術(shù)測定骨小梁微觀力學(xué)特性,病理學(xué)觀察骨吸收和新骨形成情況,ALP染色和 TRAP染色鑒定成骨/破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)比較。
　　結(jié)果:
　　1.顯微CT結(jié)果顯示,空白對照組中移植的脫細(xì)胞骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊,高濃度組

15、和中濃度組中移植骨邊界清楚且小梁結(jié)構(gòu)完整,低濃度組中移植骨部分小梁結(jié)構(gòu)不清。與空白對照組相比,高濃度組和中濃度組脛骨近端和移植骨周圍可見大量高密度組織生成。
　　2.骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析顯示,與空白對照組相比,在高濃度組和中濃度組中脛骨近端宿主骨骨礦密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BVF)、骨小梁數(shù)量(Tb.N.)顯著增高,骨小梁厚度(Tb.Th.)和骨小梁間隙(Tb.Sp.)顯著降低;高濃度組和中濃度組中移植骨骨礦密度(BMD)顯著高于

16、對照組,三組實(shí)驗(yàn)組中移植骨骨體積分?jǐn)?shù)(BVF)和骨小梁數(shù)量(Tb.N.)均顯著高于對照組,而骨小梁厚度(Tb.Th.)卻顯著低于對照組,骨小梁間隙(Tb.Sp.)四組間無顯著差異。
　　3.對于脛骨近端宿主骨病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,在高濃度組和中濃度組中脛骨近端和移植骨周圍可見大量新生骨組織。對于移植骨病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,在空白對照組中可見骨小梁斷裂且結(jié)構(gòu)紊亂;在高濃度組和中濃度組中骨小梁結(jié)構(gòu)完整排列有序,移植骨與宿主骨之間存在明顯界

17、限,被大量纖維組織填充;在低濃度組中部分骨小梁結(jié)構(gòu)完整,少量纖維組織填充。
　　4.對于脛骨近端宿主骨骨小梁納米壓痕測定結(jié)果顯示,與空白對照組相比,三組實(shí)驗(yàn)組中宿主骨骨小梁彈性模量和硬度均顯著降低。對于移植骨骨小梁納米壓痕測定結(jié)果顯示,三組實(shí)驗(yàn)組移植骨骨小梁彈性模量和硬度均顯著高于空白對照組。
　　5.破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,高濃度和中濃度組脛骨近端宿主骨周圍破骨細(xì)胞數(shù)量顯著少于空白對照組;三組實(shí)驗(yàn)組中移植骨周圍破骨細(xì)胞數(shù)量均