骨壞死修復機制及局部應用唑來膦酸調節(jié)成骨-破骨活動的研究.pdf

1、第一部分:局部冷熱交替和注射無水乙醇致骨壞死修復機制的研究
　　目的:
　　探索局部冷熱交替和注射無水乙醇致大鼠股骨髁發(fā)生骨壞死的可能,比較不同損傷方式致骨壞死后骨修復的差異,分析成骨/破骨活動在骨壞死修復過程中的作用。
　　方法:
　　30只成年SD大鼠隨機分成兩組:一組通過采用液氮-恒溫水交替方式在大鼠右側股骨髁進行冷熱損傷造模,另一組在右側股骨髁采用局部注射無水乙醇的方式造模,左側股骨髁設為正常對照組。術后

2、8周處死實驗動物獲取股骨髁標本后,采用顯微CT進行骨形態(tài)計量學分析,納米壓痕技術測定骨小梁微觀力學特性,病理學觀察并測定骨形成速率,ALP染色和TRAP染色鑒定成骨/破骨細胞并計數(shù)比較。
　　結果:
　　1.顯微CT結果顯示,與正常對照組相比,冷熱損傷組骨礦密度(BMD)、骨體積分數(shù)(BVF)、骨小梁數(shù)量(Tb.N.)顯著降低;無水乙醇組骨礦密度(BMD)、骨體積分數(shù)(BVF)、骨小梁厚度(Tb.Th.)顯著增高。
　

3、　2.病理學結果顯示,在兩種損傷組中均可見大量死骨形成,空骨陷窩明顯,冷熱損傷組骨小梁結構斷裂紊亂,無水乙醇組壞死骨小梁結構完整并且周圍可見大量新生骨。
　　3.四環(huán)素-鈣黃綠素標記結果顯示,與正常對照組相比,無水乙醇組骨形成率顯著增高;而冷熱損傷組無顯著差異。
　　4.納米壓痕測定結果顯示,與正常對照組相比,無水乙醇組骨小梁微觀彈性模量和硬度無顯著差異;而冷熱損傷組顯著降低。
　　5.成骨/破骨細胞計數(shù)結果顯示,與正

4、常對照組相比,無水乙醇組破骨細胞數(shù)量顯著減少,而成骨細胞數(shù)量顯著增加;冷熱損傷組破骨細胞數(shù)量顯著增加,成骨細胞數(shù)量無顯著差異。
　　結論:
　　1.局部冷熱交替損傷和注射無水乙醇均可以導致骨壞死發(fā)生。
　　2.局部冷熱交替損傷致骨壞死修復時,破骨活動增強,骨小梁微觀力學性能降低,呈破壞性修復。
　　3.局部注射無水乙醇致骨壞死修復時,成骨活動增強,破骨活動減弱,骨小梁微觀力學性能升高,呈重建性修復。
　　第

5、二部分:PLGA局部緩釋唑來膦酸促進骨形成的研究
　　目的:
　　觀察PLGA局部緩釋唑來膦酸對骨組織代謝的影響,探討雙膦酸鹽局部緩釋調節(jié)成骨/破骨活性的機制。
　　方法:
　　40只成年SD大鼠隨機分成四組:右側股骨髁分別植入不同含量唑來膦酸的PLGA藥棒:1.空白對照組(0μg);2.低劑量組(唑來膦酸3μg);3.中劑量組(唑來膦酸30μg);4.高劑量組(唑來膦酸300μg)。術后6周處死實驗動物獲取股骨

6、髁標本后,采用顯微CT進行骨形態(tài)計量學分析,病理學染色觀察骨形成情況,ALP染色和 TRAP染色鑒定成骨/破骨細胞并計數(shù)比較,免疫組織化學染色分析骨形成相關因子表達。
　　結果:
　　1.顯微CT結果顯示,在中劑量組和高劑量組中,股骨髁骨骺近端可見大量礦化組織形成。三種劑量唑來膦酸緩釋組中的平均骨礦密度(BMD)和骨體積分數(shù)(BVF)都顯著高于空白對照組。中劑量組和高劑量組中骨小梁平均厚度(Tb.Th.)顯著高于低劑量組和空

7、白對照組。
　　2.病理學結果顯示,在中劑量組和高劑量組中,大量新生骨組織形成,但是骨小梁板層結構不明顯,排列結構紊亂,呈不成熟新生網(wǎng)織骨表現(xiàn)。
　　3.成骨/破骨細胞計數(shù)結果顯示,與空白對照組相比,中劑量組和高劑量組中破骨細胞數(shù)量顯著減少,成骨細胞數(shù)量顯著增加。
　　4.免疫組織化學結果顯示,與空白對照組相比,中劑量組和高劑量組中骨形成相關因子:骨形態(tài)蛋白2(BMP2),骨鈣蛋白(OCN),骨形態(tài)蛋白7(BMP7),

8、Ⅰ型膠原(ColⅠ)和Runt相關轉錄因子2(RUNX2)的表達均顯著增高。
　　結論:
　　1.PLGA緩釋唑來膦酸能夠促進局部骨組織形成,但是新生骨組織病理學表現(xiàn)為不成熟的網(wǎng)織骨。
　　2.PLAG緩釋不同濃度的唑來膦酸能夠抑制局部破骨細胞介導的破骨活動,促進成骨細胞介導的成骨活動。
　　3.PLAG緩釋不同濃度的唑來膦酸能夠促進局部骨形成相關因子的表達。
　　第三部分:復合唑來膦酸脫細胞骨基質的制備及

9、對體外培養(yǎng)成骨/破骨細胞的影響
　　目的:
　　利用唑來膦酸對骨組織的高親和性,將不同濃度唑來膦酸與脫細胞骨基質復合,觀察其對體外成骨/破骨細胞共培養(yǎng)體系的影響。
　　方法:
　　采用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)去污劑方法制備豬脫細胞松質骨骨基質,將脫細胞骨基質浸潤于不同濃度的唑來膦酸溶液(空白對照組、10-5M組、10-6

10、M組和10-7M組)24小時,使唑來膦酸與脫細胞骨基質進行復合。采用核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator for nuclear factor-κ B ligand,RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)體外建立大鼠成骨/破骨細胞共培養(yǎng)體系,與復合唑來膦酸的脫細胞骨基質聯(lián)合培養(yǎng)7天后,ALP染色和TRAP染色鑒定成骨/破骨細胞

11、并計數(shù)比較,實時定量qRT-PCR和蛋白印跡法Western blot分析成骨/破骨相關基因和蛋白的表達。
　　結果:
　　1.TRAP染色破骨細胞計數(shù)結果顯示,與空白對照組相比,復合不同濃度的脫細胞骨基質均能顯著抑制破骨細胞的形成。
　　2.ALP染色成骨細胞計數(shù)結果顯示,與空白對照組相比,復合不同濃度的脫細胞骨基質均能顯著促進成骨細胞的形成。
　　3.qRT-PCR結果顯示,與空白對照組相比,高濃度和中濃度組

12、中RANK基因表達顯著降低,低濃度組中RANKL基因表達顯著降低,三組實驗組中OPG基因表達均顯著增高。
　　4.Western blot結果顯示,與空白對照組相比,高濃度和中濃度組中RANK因子表達顯著降低,中濃度組中RANKL因子表達增高,低濃度組中RANKL因子表達顯著降低,三組實驗組中OPG因子表達均顯著增高。
　　結論:
　　1.復合唑來膦酸脫細胞骨基質可以有效在體外抑制破骨細胞的增殖和分化。
　　2.

13、復合唑來膦酸脫細胞骨基質可以有效在體外促進成骨細胞的增殖。
　　3.復合唑來膦酸脫細胞骨基質可以升高成骨-破骨共培養(yǎng)體系中OPG/RANKL比率。
　　第四部分:復合唑來膦酸脫細胞骨基質促進局部骨形成的研究
　　目的:
　　觀察復合唑來膦酸脫細胞骨基質對體內骨組織代謝的影響,探索通過復合雙膦酸鹽調節(jié)成骨/破骨活性防止移植骨吸收,促進宿主骨形成的可能方法。
　　方法:
　　40只成年SD大鼠隨機分成四組

14、,將復合不同濃度唑來膦酸豬脫細胞骨基質(空白對照組、10-5M組、10-6M組和10-7M組)植入大鼠脛骨近端預制骨隧道,術后8周處死實驗動物獲取脛骨近端標本后,采用顯微CT分別對移植骨和宿主骨進行骨形態(tài)計量學分析,納米壓痕技術測定骨小梁微觀力學特性,病理學觀察骨吸收和新骨形成情況,ALP染色和 TRAP染色鑒定成骨/破骨細胞并計數(shù)比較。
　　結果:
　　1.顯微CT結果顯示,空白對照組中移植的脫細胞骨基質結構模糊,高濃度組

15、和中濃度組中移植骨邊界清楚且小梁結構完整,低濃度組中移植骨部分小梁結構不清。與空白對照組相比,高濃度組和中濃度組脛骨近端和移植骨周圍可見大量高密度組織生成。
　　2.骨形態(tài)計量學分析顯示,與空白對照組相比,在高濃度組和中濃度組中脛骨近端宿主骨骨礦密度(BMD)、骨體積分數(shù)(BVF)、骨小梁數(shù)量(Tb.N.)顯著增高,骨小梁厚度(Tb.Th.)和骨小梁間隙(Tb.Sp.)顯著降低;高濃度組和中濃度組中移植骨骨礦密度(BMD)顯著高于

16、對照組,三組實驗組中移植骨骨體積分數(shù)(BVF)和骨小梁數(shù)量(Tb.N.)均顯著高于對照組,而骨小梁厚度(Tb.Th.)卻顯著低于對照組,骨小梁間隙(Tb.Sp.)四組間無顯著差異。
　　3.對于脛骨近端宿主骨病理學觀察結果顯示,在高濃度組和中濃度組中脛骨近端和移植骨周圍可見大量新生骨組織。對于移植骨病理學觀察結果顯示,在空白對照組中可見骨小梁斷裂且結構紊亂;在高濃度組和中濃度組中骨小梁結構完整排列有序,移植骨與宿主骨之間存在明顯界

17、限,被大量纖維組織填充;在低濃度組中部分骨小梁結構完整,少量纖維組織填充。
　　4.對于脛骨近端宿主骨骨小梁納米壓痕測定結果顯示,與空白對照組相比,三組實驗組中宿主骨骨小梁彈性模量和硬度均顯著降低。對于移植骨骨小梁納米壓痕測定結果顯示,三組實驗組移植骨骨小梁彈性模量和硬度均顯著高于空白對照組。
　　5.破骨細胞計數(shù)結果顯示,高濃度和中濃度組脛骨近端宿主骨周圍破骨細胞數(shù)量顯著少于空白對照組;三組實驗組中移植骨周圍破骨細胞數(shù)量均