唑來膦酸對(duì)頜骨影響的基因差異分析.pdf

1、目的：近年來，越來越多的關(guān)于雙膦酸鹽類藥物引起頜骨壞死的患者被報(bào)道，人們開始意識(shí)到雙膦酸鹽性頜骨壞死是長(zhǎng)期應(yīng)用雙膦酸鹽類藥物的副反應(yīng)之一。臨床上發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽性頜骨壞死的發(fā)生與外傷、感染關(guān)系密切，但雙磷酸鹽性頜骨壞死的發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。唑來膦酸是雙膦酸鹽類藥物中目前應(yīng)用最廣泛的，也是抑制骨吸收作用最強(qiáng)的。本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)SD大鼠應(yīng)用唑來膦酸后頜骨組織基因譜的變化，通過基因譜差異分析，探討唑來膦酸對(duì)頜骨的作用機(jī)制，為臨床預(yù)防

2、和治療雙膦酸鹽性頜骨壞死提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　方法：選擇健康3月齡的雌性SD大鼠24只，體重220±20g，自由攝食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組8只。A組（單純應(yīng)用唑來膦酸組）；唑來膦酸經(jīng)腹腔注射，濃度0.1mg/ml，劑量0.2mg/kg，每?jī)商煲淮?，持續(xù)8周；生理鹽水按照每100g體重0.5mL灌胃，每日一次，持續(xù)8周。B組（唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組）：唑來膦酸經(jīng)腹腔注射，濃度0.1mg/ml，劑量0.2mg/kg

3、，每?jī)商煲淮?，持續(xù)8周；將濃度0.84％鈣爾奇（碳酸鈣+維生素D）混懸液按照每100g體重按0.5mL灌胃，每日一次，持續(xù)8周。C組（對(duì)照組）：按照SD大鼠體重2ml/kg腹腔注射無菌生理鹽水，每?jī)商煲淮危掷m(xù)8周；生理鹽水按照每100g體重0.5mL灌胃，每日一次，持續(xù)8周。8周后，三組動(dòng)物均停藥，每組8只大鼠再隨機(jī)分為拔牙組（2只）和非拔牙組（6只），拔牙組：在10%水合氯醛全麻下拔除SD大鼠左側(cè)下頜第一臼齒，而后繼續(xù)飼養(yǎng)4周處死取

4、下頜骨。非拔牙組：在喂藥開始后的第8周、10周、12周時(shí)分別將每組SD大鼠隨機(jī)處死2只，取大鼠下頜骨。所有動(dòng)物均存活到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在處死前均無異常表現(xiàn)及不良反應(yīng)。所有的標(biāo)本立即投入液氮中冷凍，然后將標(biāo)本放入零下80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用TRIZOL法提取頜骨的總RNA，測(cè)定RNA的純度及完整性。應(yīng)用Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)所有標(biāo)本的基因水平并掃描分析。采用Transcriptome Analysis Console v3

5、.0分析軟件對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行分析，篩選差異基因。
　　目的：近年來，越來越多的關(guān)于雙膦酸鹽類藥物引起頜骨壞死的患者被報(bào)道，人們開始意識(shí)到雙膦酸鹽性頜骨壞死是長(zhǎng)期應(yīng)用雙膦酸鹽類藥物的副反應(yīng)之一。臨床上發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽性頜骨壞死的發(fā)生與外傷、感染關(guān)系密切，但雙磷酸鹽性頜骨壞死的發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。唑來膦酸是雙膦酸鹽類藥物中目前應(yīng)用最廣泛的，也是抑制骨吸收作用最強(qiáng)的。本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)SD大鼠應(yīng)用唑來膦酸后頜骨組織基因譜的變化，通

6、過基因譜差異分析，探討唑來膦酸對(duì)頜骨的作用機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療雙膦酸鹽性頜骨壞死提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　方法：選擇健康3月齡的雌性SD大鼠24只，體重220±20g，自由攝食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組8只。A組（單純應(yīng)用唑來膦酸組）；唑來膦酸經(jīng)腹腔注射，濃度0.1mg/ml，劑量0.2mg/kg，每?jī)商煲淮危掷m(xù)8周；生理鹽水按照每100g體重0.5mL灌胃，每日一次，持續(xù)8周。B組（唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組）：唑來

7、膦酸經(jīng)腹腔注射，濃度0.1mg/ml，劑量0.2mg/kg，每?jī)商煲淮危掷m(xù)8周；將濃度0.84%鈣爾奇（碳酸鈣+維生素D）混懸液按照每100g體重按0.5mL灌胃，每日一次，持續(xù)8周。C組（對(duì)照組）：按照SD大鼠體重2ml/kg腹腔注射無菌生理鹽水，每?jī)商煲淮危掷m(xù)8周；生理鹽水按照每100g體重0.5mL灌胃，每日一次，持續(xù)8周。8周后，三組動(dòng)物均停藥，每組8只大鼠再隨機(jī)分為拔牙組（2只）和非拔牙組（6只），拔牙組：在10%水合氯醛

8、全麻下拔除SD大鼠左側(cè)下頜第一臼齒，而后繼續(xù)飼養(yǎng)4周處死取下頜骨。非拔牙組：在喂藥開始后的第8周、10周、12周時(shí)分別將每組SD大鼠隨機(jī)處死2只，取大鼠下頜骨。所有動(dòng)物均存活到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在處死前均無異常表現(xiàn)及不良反應(yīng)。所有的標(biāo)本立即投入液氮中冷凍，然后將標(biāo)本放入零下80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨RIZOL法提取頜骨的總RNA，測(cè)定RNA的純度及完整性。應(yīng)用Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)所有標(biāo)本的基因水平并掃描分析。采用Tran

9、scriptome Analysis Console v3.0分析軟件對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行分析，篩選差異基因。
　　結(jié)果：
　　1.頜骨總RNA純度及完整性的鑒定
　　分光光度法測(cè)定結(jié)果：所有標(biāo)本提取的總 RNA的OD260/OD280比值均位于1.9~2.1之間，純度合格。凝膠電泳完整性鑒定結(jié)果：所有標(biāo)本提取的總 RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后均可見三個(gè)條帶出現(xiàn)，且第一條帶（28S）亮度約是第二條（18S）亮度的兩倍，最下面

10、一條（5S）最淡，說明提取的RNA完整性良好。
　　2.基因芯片檢測(cè)分析結(jié)果
　　2.1單純應(yīng)用唑來膦酸組與對(duì)照組比較:用藥后8周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)1799個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中698個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1101個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后10周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)361個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中158個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，203個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后12周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)208個(gè)基因表達(dá)發(fā)生

11、變化，其中97個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，111個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后12周拔牙組，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)180個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中98個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，82個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。
　　2.2唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組與對(duì)照組比較:用藥后8周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)1287個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中580個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，707個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后10周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)310個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中193個(gè)基因表達(dá)上調(diào)

12、，117個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后12周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)635個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中273個(gè)基因表達(dá)上調(diào),362個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后12周拔牙組，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)320個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中161個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，159個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。
　　2.3單純應(yīng)用唑來膦酸組與唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組比較:用藥后8周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)677個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中264個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，413個(gè)基因

13、表達(dá)下調(diào)；用藥后10周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)303個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中131個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，172個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后12周，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)453個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化。其中250個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，203個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；用藥后12周拔牙組，篩選條件2倍以上差異的基因共出現(xiàn)189個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中115個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，74個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。
　　2.4與骨代謝相關(guān)的差異基因分析結(jié)果:單純應(yīng)用唑來膦酸

14、組和對(duì)照組比較，用藥后8、10、12周均出現(xiàn)金屬基質(zhì)蛋白酶9（Mmp9）、趨化因子9（Ccl9）及原癌基因（c-fos）高表達(dá)；唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組與對(duì)照組比較，用藥后8、10、12周均出現(xiàn)金屬基質(zhì)蛋白酶9（Mmp9）、趨化因子9（Ccl9）及原癌基因（c-fos）及濾泡樣樹突細(xì)胞分泌蛋白（FDC-SP）高表達(dá)；單純應(yīng)用唑來膦酸組及唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組內(nèi)拔牙組均出現(xiàn)金屬基質(zhì)蛋白酶（Mmp9）表達(dá)上調(diào)且上調(diào)倍數(shù)明顯增高；唑來膦酸聯(lián)合鈣劑組內(nèi)拔

15、牙組發(fā)現(xiàn)濾泡樣樹突細(xì)胞分泌蛋白（FDC-SP）表達(dá)上調(diào)。對(duì)這些基因進(jìn)行pathway分析，金屬基質(zhì)蛋白酶9（Mmp9）、趨化因子9（Ccl9）及原癌基因（c-fos）是骨代謝關(guān)系密切的MAPK信號(hào)通路及RANK/RANKL信號(hào)通路上的重要調(diào)節(jié)基因。濾泡樣樹突細(xì)胞分泌蛋白（FDC-SP）主要參與牙周的防御反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.SD大鼠全身應(yīng)用唑來膦酸后頜骨的基因譜發(fā)生改變，一部分基因表達(dá)上調(diào)，一部分基因表達(dá)下調(diào)。其中金屬

16、基質(zhì)蛋白酶9（Mmp9）、趨化因子9（Ccl9）、原癌基因（c-fos）及濾泡樣樹突細(xì)胞分泌蛋白（FDC-SP）明顯上調(diào)。
　　2.金屬基質(zhì)蛋白酶9（Mmp9）、趨化因子9（Ccl9）、原癌基因（c-fos）可能通過MAPK信號(hào)通路及RANK/RANKL信號(hào)通路來影響頜骨的骨代謝。
　　3.鈣劑、維生素D與唑來膦酸的同時(shí)應(yīng)用與單純應(yīng)用唑來膦酸對(duì)頜骨的影響是有差異的。鈣劑、維生素D與唑來膦酸的同時(shí)可能通過上調(diào)與牙周防御相關(guān)的濾